血凝抑制實驗報告三篇
血凝抑制實驗報告一
禽流感血凝和血凝抑制試驗可用于血清中抗體水平的監(jiān)測，也可用于判斷未使用疫苗群體的感染狀態(tài)等。該試驗是目前世界衛(wèi)生組織和國際動物健康組織進行全球流感監(jiān)測所普遍采用的方法，而且因其具有經(jīng)濟、快速、可靠、操作簡便、能夠處理大量的樣品，并能在短時間內(nèi)報告禽流感抗體水平等優(yōu)點，已經(jīng)成為當前基層獸醫(yī)實驗室禽流感疫病監(jiān)測和免疫抗體檢測中最為常用的方法。但因該試驗受人為操作影響較大，經(jīng)常因操作不規(guī)范、不嚴謹?shù)仍斐山Y(jié)果偏差大、重復性差等問題，現(xiàn)根據(jù)幾年來的工作經(jīng)驗對該試驗過程中應注意的事項做一探討。
一、 血凝試驗操作程序
1、取96孔90°V形酶標板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。
2、吸取25 μL標準禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混勻。
3、從第1孔吸取25 μL混勻后的抗原液加到第2孔中，混勻后吸取25μL加入到第3孔中，依次進行倍比稀釋至第二排最后一孔即第24孔，最后棄去25 μL。第三排孔至第四排孔同上操作。
4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的雞紅細胞懸液。
5、將酶標板置于微量振蕩器上振蕩10秒，室溫（20-25℃）靜置30 min觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下）。
6、結(jié)果判定：將板作45°傾斜，觀察紅細胞是否呈淚滴狀流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)為1個血凝單位（HAU）
二、血凝抑制試驗操作程序
1、根據(jù)血凝試驗結(jié)果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4）
2、取96孔V形酶標板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。
3、在第1孔加入25 μL被檢血清，充分混勻后移出25 μL加至第2孔，依次類推，倍比稀釋至第12孔，棄去25 μL。
4、按以上步驟加入陽性血清和陰性血清（各做兩份），作對照孔。
5、在第1~12孔各加入25 μL 4單位抗原，置于微量振蕩器上輕輕混勻，室溫20-25℃下靜置30 min。
6、每孔加入25 μL 1%的雞紅細胞懸液。置于微量振蕩器上輕輕混勻，室溫（20-25℃）靜置40 min后觀察結(jié)果，若環(huán)境溫度過高，可于4℃條件下進行，紅細胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底。
7、結(jié)果判定：只有陰性對照孔血清滴度不大于2 log2，陽性對照孔誤差不超過1個滴度，試驗結(jié)果才有效。 將酶標板作45°傾斜，以完全抑制紅細胞凝集的最大稀釋倍數(shù)判為該血清的血凝抑制滴度。當被檢血清效價大于等于4log2，判為禽流感抗體陽性。
三、試驗過程中的注意事項
1樣品的保存及試驗前處理
1.1 采集的血液樣品應及時分離血清，最好分裝至離心管中，標記清楚，離心后吸出血清，對應編號冷藏送檢，并禁止運輸過程中劇烈震動。
1.2 一般情況下，在5天內(nèi)檢測的樣品可放置在4℃的冰箱中冷藏，否則低溫冷凍保存。
1.3 在檢測前血清樣品應充分混勻，混勻時采用上下緩慢顛倒幾次的方法即可，切忌劇烈振蕩而引起產(chǎn)生氣泡及血清中蛋白變性。
1.4 對出現(xiàn)膠凍狀的血清樣品，可采用反復攪動幾下再離心的方法有助于緩解該狀態(tài)。膠狀物是含纖維蛋白和纖維蛋白原的血清，可能是由于放置時間不夠造成的血清未完全析出狀態(tài)。不建議直接吸取其中少量的清亮血清。
1.5 水禽等樣品為排除非特異性反應，還應相應進行滅能反應。具體操作方法：56℃水浴鍋30min或加等量10%雞紅細胞，輕搖后靜置30分鐘，離心，收集上清液即可。
2器材的選擇
2.1 酶標板的選擇：
建議使用96孔90°V型板進行試驗，通過反復試驗證明：90°V型板相對于110°板及130°板來講，具有紅細胞沉降速度快，產(chǎn)生的凝集圖像清晰、結(jié)果容易判定等優(yōu)點。
2.2 移液槍的選擇及使用：
�、賳蔚�、多道可調(diào)微量移液槍應選擇合適的量程，以便精確度的提高。
�、谑褂脮r應采用一檔吸液二檔排液的方法。吸取液體時，槍頭要深入液下緩慢平穩(wěn)吸液。加緩沖液時
應加在板孔底部。倍比稀釋血清時，應每孔至少反復吹吸6次，以便混合均勻，還應注意盡量避免產(chǎn)生泡沫引起混合不均。加抗原及紅細胞時應在板內(nèi)液面上方加樣，以免交叉污染，影響試驗結(jié)果。
�、奂訕�、倍比稀釋時應高度集中注意力，以免漏加、重復加樣等。
3試劑的保存及配置
3.1 禽流感血凝抑制試驗所用的抗原、陽性血清應嚴格按照說明書的要求進行保存和配置，試驗前應提前將其恢復至室內(nèi)溫�？乖谋４鏈囟葹�-20℃，反復凍融會降低抗原的滴度，應避免反復凍融。
3.2 PH7.2、0.01mol/L的PBS液的制備
�、賾M量現(xiàn)用現(xiàn)配
�、诿看问褂们皯獪yPH值，以免時間過長而導致PH值發(fā)生改變。
�、塾捎赑H試紙跨度范圍偏大，PH值不易準確介定，因此最好采用酸度計準確測量PH值，以提高試驗的精確度。
�、苋吭囼灳捎猛环N稀釋液。
3.3 1%紅細胞的制備
�、贋楸苊庥行╇u只的紅細胞有自凝現(xiàn)象，因此配制1%紅細胞懸液時應最好選擇采取2-3只SPF雞或未進行過任何免疫過的成年公雞血液。當然采血的前提條件是要按十分之一采血量比例在一次性注射器中加入抗凝劑，如肝素、枸椽酸鈉、檸檬酸鈉等。
�、诓裳戤吅笞詈梅盅b至2ml容量的圓底離心管中，因為通過2ml與1.5ml兩種容量離心管相比較，放入1.5ml尖底離心管中的話，離心后，離心管底部紅細胞不易與加入的PBS液混勻，易沉積在管底部，達不到洗脫干凈的目的。
�、劢�(jīng)2000~3000r/min，5~10min，棄去上液和紅細胞上層的白細胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下緩慢顛倒（切忌用力過大使紅細胞破裂），使其充分混勻，再離心棄去上清液，反復幾次直至上清液清亮透明為止。
�、茉诩蛹t細胞過程中還須不斷輕搖以確保紅細胞均勻，使其每孔加入相同數(shù)量的紅細胞。
�、葜苽浜玫募t細胞液如果放置后上清液變紅，說明有溶血，不可再使用。
3.4抗原液的配制
�、傧茸鲅囼灉y定效價，以抗原與紅細胞完全凝集的孔為1HUA抗原，配制4HUA抗原應往前推算兩孔，即除以4后的值。
�、诿看巫鲈囼炃�，必須重新檢測禽流感抗原的.血凝效價，以免效價發(fā)生改變而導致抗原稀釋倍數(shù)不準確，從而導致試驗結(jié)果不準確。
�、蹫楸ＷC配制的抗原準確，還要進行抗原回滴試驗。具體方法：做二排抗原回滴，在兩排的第1~8孔各加25微升PBS，取4HAU抗原25微升加在兩排的第1、第2孔，混勻，從第2孔倍比稀釋至第4孔，棄去25微升，另一排同樣。從第2至第8孔補25微升PBS，以保持75微升總量不變，另一排同樣。兩排的第1至第8孔各加25微升1%紅細胞，震蕩10秒鐘。靜置30分鐘觀察結(jié)果。這樣在第1孔為4HAU抗原，第2孔為2HAU抗原，第3孔為1HAU抗原，第4孔為1/2HAU抗原，均為75微升總量，第5至第8孔為空白對照。如果抗原回滴試驗不成立，應相應調(diào)整抗原濃度直至回滴試驗成立。因為如果抗原濃度過高，則所測定的抗體效價水平偏低，如果抗原濃度過低，則所測定的效價偏高。所以不調(diào)整抗原濃度至實驗成立的話會對結(jié)果有很大影響。
4結(jié)果的判定
每次試驗必須設陽性及陰性（空白）對照血清，判別試驗是否成立。判讀結(jié)果時，將酶標板傾斜45°，以孔底沉淀的紅細胞流動性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無凝集顆粒為凝集完全抑制。
5試驗器具的清洗
每次試驗完畢后，應將酶標板中液體甩凈，然后用自來水反復沖凈每個孔，再放入3%NaOH中4小時，清水反復沖凈，再放入3%Hcl中4小時，清水反復沖凈，再用蒸餾水反復沖洗幾次，甩干水份，入干燥箱中干燥備用。實驗用燒杯、加樣槽、量筒等也應充分洗凈、干燥。以免器具內(nèi)有雜物、污物以及殘留物從而影響試驗結(jié)果。
四、小結(jié)
在進行禽流感血凝抑制試驗時，應充分考慮到各方面的影響因素，提供的檢測結(jié)果才會真實可靠，準確掌握禽類的免疫抗體水平，進而為科學防控禽流感提供理論依據(jù)。
血凝抑制實驗報告二
一、原理
流感病毒顆粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有識別并吸附于紅細胞表面受體的結(jié)構，HA試驗由此得名。HA蛋白的抗體與受體的特異性結(jié)合能夠干擾HA蛋白與紅細胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。
二、應用
該試驗是目前WHO進行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗方法�？捎糜诹鞲胁《痉蛛x株HA亞型的鑒定，也可用來檢測禽血清中是否有與抗原亞型一致的感染或免疫抗體。
三、缺點
只有當抗原和抗體HA亞型相一致時才能出現(xiàn)HI現(xiàn)象，各亞型間無明顯交叉反應；除雞血清以外，用雞紅細胞檢測哺乳動物和水禽的血清時需要除去存在于血清中的非特異凝集素；需要在每次試驗時進行抗原標準化；需要正確判讀的技能。
四、試驗步驟
1 阿氏（Alsevers）液配制
稱量葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，散熱溶解后調(diào)pH值至6.1，
69kPa 15min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆�。�?.8%枸櫞酸鈉（3.8g枸櫞酸鈉，100ml超純水），101 kPa,20min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?保存期1個月）。
2 10%和1%雞紅細胞液的制備
2.1采血
用注射器吸取阿氏液約1mL（3.8%枸櫞酸鈉），取至少2只SPF雞（如果沒有SPF雞，可用常規(guī)試驗證明體內(nèi)無禽流感和新城疫抗體的雞），采血約2～4mL，與阿氏液混合（3.8%枸櫞酸鈉），放入裝10mL阿氏液（生理鹽水）的離心管中混勻。
2.2 洗滌雞紅細胞
將離心管中的血液經(jīng)1500～1800 r/min 離心8分鐘，棄上清液，沉淀物加入阿氏液（生理鹽水），輕輕混合，再經(jīng)1500～1800 r/min離心8分鐘，用吸管移去上清液及沉淀紅細胞上層的白細胞薄膜，再重復2次以上過程后，加入阿氏液20 mL（生理鹽水），輕輕混合成紅細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆茫怀^5天。
2.3 10%雞紅細胞懸液
取阿氏液保存不超過5天的紅細胞，在錐形刻度離心管中離心1500～1800 r/min 8分鐘，棄去上清液，準確觀察刻度離心管中紅細胞體積(mL)，加入9倍體積(mL)的生理鹽水，用吸管反復吹吸使生理鹽水與紅細胞混合均勻。（此步
可省略，直接配制1%紅細胞）
2.4 1%雞紅細胞液
取混合均勻的10%雞紅細胞懸液1 mL，加入9 mL生理鹽水，混合均勻即可。（根據(jù)檢測血清的數(shù)量，估算一下需要的1%雞紅細胞量，可按0.3ml/每份血清）
3 抗原血凝效價測定（HA試驗，微量法）
3.1 在微量反應板的1孔～12孔均加入25μl PBS（生理鹽水），換滴頭。
3.2吸取25μl抗原加入第l孔，混勻。
3.3從第1孔吸取25μl，病毒液加入第2孔，混勻后吸取25μl加入第3孔，如此進行倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸取25μl棄之，換滴頭。
3.4每孔再加入25μl PBS（生理鹽水）。
3.5每孔均加入25μl 體積分數(shù)為1%雞紅細胞懸液（將雞紅細胞懸液充分搖勻后加入）。
3.6振蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置40min后觀察結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4℃環(huán)境下反應1小時）。對照孔紅細胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。
3.7結(jié)果判定 將板傾斜，觀察血凝板，判讀結(jié)果。
能使紅細胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀釋度為該抗原的血凝效價，此效價為1個血凝單位（HAU）。注意對照孔應呈現(xiàn)完全不凝集（-），否則此次檢驗無效。
4 血凝抑制（HI）試驗（微量法）
4.1 根據(jù)3的試驗結(jié)果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。例如，如果血凝的終點滴度為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應是1:64（256除以4）。
4.2 在微量反應板的1孔～11孔加入25μl PBS（生理鹽水），第12孔加入50μl PBS（生理鹽水）。
4.3 吸取25μl血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸25μl于第2孔，依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25μl棄去。
4.4 1孔～11孔均加入含4HAU抗原25μl，室溫（約20℃）靜置至少30min。
4.5 每孔加入25μl 1%的雞紅細胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進行），對照紅細胞將呈現(xiàn)鈕扣狀沉于孔底。
4.6 結(jié)果判定
試驗成立的條件：只有陰性對照孔血清滴度不大于21og2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結(jié)果才有效。
以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。
HI價小于或等于31og2判定HI試驗陰性；HI價大于或等于41og2為陽性。
五、HI試驗注意事項
1、合理選擇抗原和對照陽性血清。針對Re-4和Re-5株疫苗免疫采用相應抗原和對照陽性血清。
同一亞型的禽流感病毒制成的抗原，如果毒株來源不同，則可能會存在抗原性差異，從而使檢測同一血清的結(jié)果有差別。一般來講，疫苗種毒株如果與抗原所用毒株相同時，則所測得的HI效價較高。
2、合理使用和保存抗原。反應試劑要按規(guī)定保存和使用，凍干的試劑應按照說明中規(guī)定的體積重新溶解并保存。要避免雜菌污染，因為污染所造成的非流感起源的凝集素也可與所有抗血清發(fā)生非特異反應。為避免反復凍融和細菌污染，可以無菌操作將試劑分裝成小包裝。
3、反應溫度不能太高。若在37℃ （如溫箱）下進行，
血凝抑制實驗報告三
隨著養(yǎng)殖業(yè)的飛速發(fā)展和廣大養(yǎng)殖戶科學意識的不斷提高，人們普遍認識到實驗室檢測技術在臨床應用的重要性。下面簡單介紹一下雞新城疫微量血凝試驗和血凝抑制試驗的注意事項及操作方法。
應用：
用于新城疫、產(chǎn)蛋下降綜合征和傳梁性支氣管炎等的母源抗體的檢測、雛雞首免日齡的確定、疫苗免疫后的免疫應答的監(jiān)測、臨床雞病的鑒別診斷等。
下面以新城疫病毒為例，介紹血凝和血凝抑制試驗的方法：
注意事項：
一、樣本要具有代表性：所采樣本要能代表整體，通常采用四角加中間的隨機取樣法，并且確定適當?shù)臉悠窋?shù)量，一般1000只以下的雞群采樣率在2～5%；5000只以下1～2%；5000只以上0.5～1%。對產(chǎn)蛋期間的雞群可采雞蛋；對雛雞或青年雞，可采血。方法是：取青霉素小瓶，洗凈后用蒸餾水沖洗、控干水分，并注意不要用消毒劑，以免影響結(jié)果。每只雞采血量在1ml左右，最好不低于1ml，在室溫下靜置至血清自然析出。
二、四單位抗原的準確性：要獲得準確的監(jiān)測效果，先做紅血球的凝集試驗，即測得抗原的血凝價，爾后前移2孔作為四單位抗原的稀釋度。
三、紅血球洗脫的充分性：原則上，新城疫檢測所用的紅血球應來源于非疫苗免疫過的健康公雞，但實際上卻多采用免疫過疫苗的健康公雞，有時甚至是病雞。因此，對紅血球的洗脫的次數(shù)要多、要充分，并注意轉(zhuǎn)速和時間，通常采用五次變速離心法：前四次為每分鐘1500轉(zhuǎn)，每次5分鐘，最后一次為每分鐘3000轉(zhuǎn)，持續(xù)7～8分鐘。另外，洗紅血球過程中，應注意動作要輕，玻璃儀器之間盡量減少碰撞，以免造成紅血球破裂而影響結(jié)果。
四、結(jié)果判定的及時性：檢測中，每次試驗均應設抗原與生理鹽水對照，加入紅血球后，每隔5分鐘觀察一次，一旦兩列對照孔圖像清晰地顯示出來時，應立即對樣本進行結(jié)果判定，過早過晚都會影響判定結(jié)果的準確性。
血凝與血凝抑制試驗的操作方法
一、材料與儀器：新城疫抗原、1%雞紅血球、抗凝劑、生理鹽水、被檢血清、離心機、吸管、滴管、洗耳球、燒杯、量筒、注射器、長針頭、96孔V型醫(yī)用血凝板、微量移液器、微量振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱等。
二、方法：
1%雞紅血球的制備：
1.用長針刺入雞心臟或翅下靜脈，采血，采血量視用量而定，5%抗凝劑與全血的比例為1∶3～4。
2.洗血球：共洗4～5次，每次5～8分鐘，紅血球與生理鹽水的比例至少為1∶2～3。離心機轉(zhuǎn)速為每分鐘1500～3000轉(zhuǎn)，最后傾去上清。
3.吸紅血球泥1ml加生理鹽水99ml，配成1%紅血球備用。
三、血凝試驗：
1.血凝板上12個孔內(nèi)全部加入生理鹽水，每孔0.05ml，吸等量新城疫抗原于第一孔內(nèi)，混勻后吸出同量于第二孔內(nèi)混勻，以此類推稀釋至第11孔，并棄去0.05ml，留第12孔作為生理鹽水對照，然后全部孔內(nèi)加入1%雞紅血球。
2.將血凝板置于振蕩器上振蕩1～2分鐘，使材料充分混均，放入恒溫培養(yǎng)箱，每5分鐘觀察一次，至10～15分鐘取出，一般以生理鹽水對照孔的圖象清析地出現(xiàn)為準。
3.結(jié)果判定：紅血球在反應板底部全部均勻鋪開為完全凝集（++++），在血凝板底部集為一小紅點為沉淀（－），如底部為一小紅點，四周為凝集的紅細胞，則為不完全凝集（++）。
4.出現(xiàn)完全凝集的抗原的最高稀釋度，即為該抗原的凝集價。
5.四單位抗原的制備：血凝試驗的結(jié)果如為28（256），則前移2孔即26（64），作為四單位抗原的稀釋度。即：63ml生理鹽水+1ml抗原即為四單位抗原。
四.血凝抑制試驗：
1.血凝板上1～11孔全部加入0.05ml的生理鹽水，于第一孔內(nèi)加入等量的被檢抗體，稀釋至第10孔，棄去0.05ml，再加入等量的4單位新城疫抗原至第11孔，第11孔為抗原對照，12孔為生理鹽水對照。在振蕩器上振蕩1～2分鐘，放置室溫約20分鐘，然后加入等量的1%雞紅血球，振蕩后放入恒溫培養(yǎng)箱大約10～15分鐘后進行結(jié)果判定。
2.結(jié)果：能完全抑制紅細胞凝集的被檢抗體的最高稀釋度為該被檢抗體的血凝抑制滴度。
注：1、HI價在23～24時免疫可產(chǎn)生良好的免疫應答，如在疫區(qū)可提高到24～25免疫。
2、24～25<HI<210時為最好。3、如HI價高于211則為強毒污染。
注：#為完全抑制，++為不完全抑制，－為不抑制。
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