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分離培養(yǎng)及鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法探析論文
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）也被稱為間質(zhì)祖細(xì)胞，由于其巨大的增殖和多向分化潛能，被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)、基因治療和細(xì)胞治療的理想種子來(lái)源，已被廣泛進(jìn)行研究[1-3].目前，BMSCs在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用上取得了巨大的成果，在骨、軟骨、肌腱、神經(jīng)膠質(zhì)修復(fù)、心臟疾病、心肌梗塞、肝臟損傷等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干細(xì)胞和異基因干細(xì)胞治療所涉及的倫理道德和免疫排斥問(wèn)題，有利于細(xì)胞移植。但是骨髓中的BMSCs含量極少，約占骨髓全細(xì)胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在體外分離純化、培養(yǎng)擴(kuò)增來(lái)滿足臨床應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)研究。研究表明，不同分離方法和首次換液方式對(duì)BMSCs的增殖培養(yǎng)有很大的影響[8].本試驗(yàn)通過(guò)觀察2種不同分離方法和不同首次換液時(shí)間對(duì)兔BMSCs生物活性的影響，旨在建立一種有效的分離培養(yǎng)及鑒定BMSCs的方法，以便獲得大量、高純度、高活性、培養(yǎng)周期短的BMSCs,為下一步研究和臨床實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1月齡雄性新西蘭大耳白兔1只，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.2主要試劑和儀器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜爾迪生物公司）；DMSO（Gibco）；紅細(xì)胞裂解液（北京賽馳生物技術(shù)有限公司）；生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記鏈霉親和素、DAB顯色試劑盒、改良型蘇木素（北京華肽先鋒）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗體（北京博奧森）；封閉山羊血清（北京博奧森）。
HF151UV型CO2培養(yǎng)箱（Heal Force）；倒置顯微鏡（Leica）;800型離心機(jī)、85-2恒溫磁力攪拌器：金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；數(shù)碼相機(jī)：日本佳能IXUS 980IS;電子天平：METTLER TOLEDO AL104;超凈工作臺(tái)：AIR TECH;FX101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；pH計(jì)：上海雷磁儀器廠。
1.3 BMSCs的提取用陸眠寧（846）將1月齡新西蘭大耳白兔麻醉，腿部去毛消毒，無(wú)菌條件下分離股骨、脛骨，剔除脂肪和肌肉，PBS液反復(fù)沖洗，剪斷兩側(cè)干骺端，盡量多保留干骺端，DMEM-F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔于A、B兩個(gè)10mL的離心管內(nèi)，直至骨髓腔發(fā)白，1 000r/min離心5min,棄上清。
1.4全骨髓貼壁法A管用PBS重懸細(xì)胞，1 000r/min離心5min洗滌2次，棄上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12（1∶100雙抗）培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種至3個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。以后每3d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)傳 代 培 養(yǎng)。 先 棄 去 舊 培 養(yǎng) 液，PBS液 浸 洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以1∶2的比例傳代培養(yǎng)，每3d換液1次。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.5紅細(xì)胞裂解法B管加入1mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，靜置1~3min,待液體由紅色變?yōu)榘咨螅?入5 mL PBS液，1 000r/min離 心2次，5min/次，棄 上 清。 吸 取3 mL含10% FBS的DMEM-F12（1∶100雙抗）培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種至3個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。
2d后首次換液，以后每3d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)傳 代 培 養(yǎng)。 先 棄 去 舊 培 養(yǎng) 液，PBS液 浸 洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37℃條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以1∶2的比例傳代培養(yǎng)，每3d換液1次。每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.6兔BMSCs細(xì)胞活性檢測(cè)及生長(zhǎng)曲線繪制培養(yǎng)48h時(shí)，各取一瓶細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗2遍，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞（未著色）和死細(xì)胞（著色細(xì)胞）。分別計(jì)算出2種不同分離方法的細(xì)胞活性。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。
選取生長(zhǎng)良好的P1、P3和P8代細(xì)胞，以2.0×104個(gè)/孔，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL,每3d換液1次，每隔1d取3孔，消化后計(jì)數(shù)，取其平均值為當(dāng)天的細(xì)胞數(shù)，連測(cè)8d,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
1.7首次換液時(shí)間對(duì)兔BMSCs的影響將用紅細(xì)胞裂解法分離得到的兔BMSCs按首次換液時(shí)間隨機(jī)分為4組：12h換液組、24h換液組、48h換液組、72h換液組，以后每3d換液1次，記錄傳代前各組0~3代各代培養(yǎng)時(shí)間，各代細(xì)胞均保留3瓶。
1.8細(xì)胞免疫組化鑒定兔BMSCs收集紅細(xì)胞裂解法的P3代細(xì)胞，制備細(xì)胞爬片，常規(guī)SABC免疫組織 化 學(xué) 方 法 檢 測(cè) 表 面 抗 原CD34、CD、CD45、CD90的表達(dá)。
1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），用Microsoft Excel軟件作圖。
2 結(jié)果
2.1不同分離方法對(duì)兔BMSCs形態(tài)和生長(zhǎng)的影響
剛接種時(shí)，2種不同分離方法所得的原代細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈圓形，大小一致，折光性強(qiáng)，不容易區(qū)分。培養(yǎng)48h后，A、B兩組細(xì)胞均可看見(jiàn)有圓形、短梭形、多角形細(xì)胞貼壁。
B組貼壁細(xì)胞較A組細(xì)胞多（圖1）。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性全骨髓貼壁法（A組）為90%,紅細(xì)胞裂解法（B組）為96%.隨著培養(yǎng)的繼續(xù)，大量細(xì)胞貼壁，并出現(xiàn)典型的BMSCs細(xì)胞集落，緊密排列。
A組細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢，所得細(xì)胞純度較低；B組細(xì)胞生長(zhǎng)較快，純度較高。原代細(xì)胞達(dá)到傳代的時(shí)間A組為10.2d,B組為7.2d,差異顯著（P<0.05）。B組細(xì)胞P3代細(xì)胞呈旋渦狀或放射狀生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)大小均一（圖2）.
2.2兔BMSCs生長(zhǎng)曲線繪制
通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，對(duì)兔BMSCs的生長(zhǎng)特性進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，P1、P3、P8代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)具有相似的特點(diǎn)：1~2d細(xì)胞處于潛伏期；3~6d細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；6~8d生長(zhǎng)逐漸減慢，開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái)期（圖3）。傳代細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)衰老的特征，增殖速度減慢。
2.3兔BMSCs的鑒定
結(jié)果顯示，CD44、CD90抗原表達(dá)陽(yáng)性，CD34抗原表達(dá)陰性（圖4），符合BM-SCs表面分子標(biāo)記特征。
2.4首次換液時(shí)間對(duì)兔BMSCs培養(yǎng)周期的影響紅細(xì)胞裂解法分離兔BMSCs,分別在12,24,48,72h首次換液，結(jié)果（表1）顯示，24h換液組P0、P1、P2、P3代以及總時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間與其他各組比較差異極顯著（P<0.01），表明24h首次換液可縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期。
3 討論
骨髓中BMSCs的含量很低，一般為0.001%~0.010%,其數(shù)量和生長(zhǎng)能力與年齡呈顯著負(fù)相關(guān)，想要在臨床實(shí)踐中利用BMSCs,就必須實(shí)現(xiàn)其在體外的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增。目前，常用的BMSCs的分離和純化方法有：全骨髓貼壁法、紅細(xì)胞裂解法、密度梯度法、免疫磁珠分選法和流式細(xì)胞術(shù)分選法，后2種方法篩選BMSCs的分選效率和純度均較高，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)備要求較高，費(fèi) 用 昂 貴，并 且BMSCs表面缺乏特異性標(biāo)志，在具體操作過(guò)程中可造成細(xì)胞的損傷和死亡，所以較少使用[9].密度梯度法由于分離液往往對(duì)BMSCs有一定的損傷，且離心會(huì)丟失大量的細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞活性有影響，因此應(yīng)用受到很大限制[10].本試驗(yàn)通過(guò)比較全骨髓貼壁法和紅細(xì)胞裂解法，發(fā)現(xiàn)2種分離方法均可得到較均一的長(zhǎng)梭形細(xì)胞，聚集成旋渦狀均勻生長(zhǎng)。但是紅細(xì)胞裂解法分離得到的BMSCs在48h時(shí)貼壁細(xì)胞顯著多于全骨髓貼壁法，并且細(xì)胞活性較高，細(xì)胞密度達(dá)到80%融合，首次傳代時(shí)間也較短。這可能是因?yàn)槿撬栀N壁分離法保留了造血干細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，在體外培養(yǎng)過(guò)程中混雜的細(xì)胞會(huì)對(duì)BMSCs的生長(zhǎng)及貼壁產(chǎn)生影響，所得BMSCs純度和細(xì)胞活性均較低；而紅細(xì)胞裂解液的有效成分是氯化銨，能夠利用紅細(xì)胞的滲透脆性特異性的破壞無(wú)核紅細(xì)胞膜而去除紅細(xì)胞和血小板，并且對(duì)有核細(xì)胞無(wú)影響，從而去除骨髓中含量最高的細(xì)胞成分，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理后，減小了雜細(xì)胞對(duì)其貼壁的影響，為BMSCs貼壁保留了空間，有利于BMSCs的早期貼壁[11],所得細(xì)胞純度高，且細(xì)胞活力不受影響。因此，利用紅細(xì)胞裂解法，能夠在較短的時(shí)間里獲得大量的高純度、高活性的目的細(xì)胞，是一種有效的分離純化BMSCs的方法。
有研究表明，首次換液時(shí)間對(duì)BMSCs的生殖增長(zhǎng)有一定的影響。原代首次換液時(shí)間過(guò)早，由于骨髓沖洗液中其他細(xì)胞分泌滋養(yǎng)BMSCs的生長(zhǎng)因子等多種有益成分丟失，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞培養(yǎng)周期延長(zhǎng)；原代首次換液時(shí)間過(guò)晚，雜質(zhì)貼壁緊密，細(xì)胞代謝產(chǎn)物等有害成分增多，造血干細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子使BMSCs出現(xiàn)分化等，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖周期延長(zhǎng)。本試驗(yàn)分別在12,24,48,72h首次換液，24h換液組，首次傳代時(shí)間及細(xì)胞培養(yǎng)總周期與其他各組比較，差異有顯著性意義，能顯著縮短細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，因此，培養(yǎng)24h首次換液為最佳首次換液時(shí)間。
BMSC目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異性的表面標(biāo)記物，其鑒定尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。
BMSC的表面抗原具有非專一性，表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、表皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞的表面標(biāo)志，它包括（1）粘附分子CD44、CD105、CD166、CD54、CD102等；（2）整 合 素 家 族 成 員CD29、CD104、CD49a等；（3）其他CD90等[12-14].不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志，如CD34、CD45、CD11b、CD11a等[15-16].BMSCs,結(jié) 果 顯 示，BMSCs陽(yáng) 性 表 達(dá)CD90和CD44,造 血 干 細(xì) 胞 標(biāo) 志CD34呈 陰 性 表 達(dá)，符 合BMSCs的表面標(biāo)志物特征，證實(shí)我們體外分離培養(yǎng)的細(xì)胞為純化的BMSCs.
綜上所述，通過(guò)紅細(xì)胞裂解液法分離得到的兔BMSCs生長(zhǎng)增殖旺盛，生物學(xué)性狀穩(wěn)定，于培養(yǎng)24h首次換液可顯著縮短細(xì)胞的培養(yǎng)周期，便于后續(xù)的試驗(yàn)研究。
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