蛋白激酶在缺血大鼠海馬神經(jīng)元細胞中的保護作用論文
研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷是對組織造成損傷的主要因素，即再次恢復血液供應，缺血組織灌注時造成的微血管和實質(zhì)器官的損傷，本研究旨在探討糖皮質(zhì)激素誘導的蛋白激酶1( SGK1) 在大腦缺血再灌注過程中可能的保護機制。
1 資料和方法
1. 1 樣本來源本研究用細胞為培養(yǎng)后的1 日齡SD 大鼠神經(jīng)元細胞。對SD 大鼠采用椎脫臼處死法處死，用75% 酒精浸泡消毒3 ～ 5 min; 取出海馬神經(jīng)元細胞進行培養(yǎng)。
1. 2 試驗方法
1. 2. 1 大鼠海馬神經(jīng)元細胞的額分離及培養(yǎng)選用1 日齡SD大鼠2 只。通過對大鼠進行消毒后處死，獲取了SD 大鼠的海馬細胞，并進行了體外培養(yǎng)。
1. 2. 2 已分離培養(yǎng)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞的'免疫熒光鑒定采用海馬神經(jīng)元特異性抗微管相關蛋白2(MAP2) 抗體免疫熒光來顯示分離和培養(yǎng)的結果，在顯微鏡下計數(shù)，記錄每個視野中染色陽性的細胞占所有細胞的比值，超過95%的為陽性。
1. 2. 3 通過氧糖剝奪誘導海馬神經(jīng)元凋亡將海馬神經(jīng)元細胞根據(jù)氧糖剝奪誘導時間不同分為正常海馬神經(jīng)元細胞組，氧糖剝奪誘導120 min 組、氧糖剝奪誘導120 min 后正�；謴�10 min組、氧糖剝奪誘導120 min 后正�；謴�30 min 組和氧糖剝奪誘導120 min 后正�；謴�60 min 組。采用Annexin VFITC/PI 流式細胞術對樣品進行檢測，區(qū)分實驗樣本中正常、壞死、凋亡細胞。
1. 2. 4 Western 印跡技術檢測上述步驟中各種細胞的SGK1 表達實驗對樣本進行總蛋白提取與定量，根據(jù)SGK1 的mRNA序列( 序列號: NM_001193568. 1) 設計了該基因的全基因引物，獲得目的基因SGK1 模板，構建質(zhì)粒載體，并進行過表達效率檢測。
1. 3 統(tǒng)計學方法采用SPSS16. 0 進行分析。
2 結果
2. 1 氧糖剝奪誘導海馬神經(jīng)元凋亡及SGK1 表達情況NC 代表未經(jīng)任何處理的培養(yǎng)過的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞、OGD 表示對培養(yǎng)過的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞進行了120 min 的氧糖剝奪，而10 min 組、30 min 組和60 min 組則表示培養(yǎng)過的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞在進行了120 min 的氧糖剝奪之后分別進行了10 min、30 min 和60 min 的氧糖正常供給。
2. 2 SGK1 基因蛋白水平的過表達能阻止氧糖剝奪120 min 的培養(yǎng)過的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞的凋亡與NC 組比較，轉染SGK1 過表達載體的細胞內(nèi)，可以SGK1 導致mRNA 的表達增加約5 倍; 在轉染了SGK1 過表達病毒載體的細胞中，SGK1 基因在蛋白水平的表達約超過未處理組的2. 5倍。海馬神經(jīng)元分別轉染了空載體或編碼SGK1 基因的表達載體; 在轉染24 h 后，
SGK1 在基因水平和蛋白質(zhì)水平的變化情況和NC 相比具有顯著性差異。海馬神經(jīng)元分別轉染了空載體或編碼SGK1 基因的表達載體24 h，然后進行120 min 的氧糖剝奪，然后使之恢復60 min; 運用流式細胞儀分析用膜聯(lián)蛋白V/PI 雙染色法來檢測細胞凋亡情況。通過免疫印跡實驗檢測SGK1 和活化的金屬基質(zhì)蛋白酶(caspase) -3 蛋白水平差異情況。
3 討論
缺血性腦血管病是目前導致人類，尤其是老年人致死和致殘率最高的疾病之一。對于缺血性腦血管病當前最主要的治療原則是對缺血區(qū)域進行血液灌注; 然而近期發(fā)現(xiàn)對缺血性腦血管疾病的缺血再灌注非但沒有使組織功能恢復，反而會導致缺血所致的功能障礙和結構破壞進一步加重，這種現(xiàn)象即缺血再灌注損傷，在各種模式生物和人類研究中都得到了一致的結果。
本研究結果發(fā)現(xiàn)，對體外培養(yǎng)的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞進行氧糖剝奪可導致SD 海馬神經(jīng)元細胞凋亡數(shù)量的增加，而之后隨著再恢復氧糖供應時間的增加，神經(jīng)元細胞凋亡的數(shù)據(jù)則呈現(xiàn)進一步加劇的趨勢。而SGK1 的過表達則可以抑制SD大鼠海馬神經(jīng)元細胞因氧糖剝奪導致的細胞凋亡的趨勢。另外本結果顯示，SGK1 的過表達能顯著降低因氧糖剝奪導致的SD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡的數(shù)量，這一結果得到了熒光輔助細胞篩選分析的支持，提示Akt 和GSK-β 可對經(jīng)受缺血再灌注海馬神經(jīng)元細胞能起到保護作用。
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