詳談RGD肽段連接的近紅外量子點對小鼠的毒性作用論文
目前功能化的量子點(quantum dots，QDs)探針已在細胞和生物分子標記示蹤、活體腫瘤成像、藥物監(jiān)測、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物芯片等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域顯示出極其重要的作用。但由于QDs核的成分為重金屬(如Cd、Se等)，其生物毒性和生物安全性引起了人們的廣泛關(guān)注。有研究表明：由于QDs核的重金屬離子釋放以及作為納米粒的QDs具有誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生活性氧自由基，從而對機體和細胞產(chǎn)生毒性作用。但另外一些研究表明：一些表面包裹有生物活性物質(zhì)的功能化QDs，在體外和體內(nèi)均未觀察到對細胞或機體的毒性作用。已有研究證實：影響功能化QDs毒性的因素很多，包括QDs核的成分組成、粒徑大小、暴露濃度、暴露時間、表面包覆材料的物理和化學(xué)性質(zhì)、作用環(huán)境、給藥途徑和作用細胞的種類等，因而不能籠統(tǒng)地將功能化QDs定義為有毒或無毒，對不同類型功能化的QDs的生物毒性需要進行個體化的評價，重要的是首先要評價不同類型功能化QDs在達到醫(yī)學(xué)應(yīng)用目的的劑量下是無毒或有毒。近年來有研究證明：將近紅外量子點(near-infrared quantum dots，NIR QDs)與RGD連接制備的NIR QD-RGD探針能與腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞表達的整合素αvβ3特異性地靶向結(jié)合，對體質(zhì)量為20～25g的小鼠，每只靜脈注射150～200pmol劑量的NIR QD-RGD探針能達到對體內(nèi)腫瘤及腫瘤新生血管清楚的成像，對癌癥的早期診斷，體內(nèi)腫瘤成像和個體化治療具有巨大的發(fā)展前景，但目前還未見NIR QD-RGD的毒性研究報道。用于臨床的制劑，無論診斷和治療，常常需要重復(fù)使用，因此重要的是要評價NIR QD-RGD在達到醫(yī)學(xué)應(yīng)用目的所需的劑量下重復(fù)使用時其毒性作用。本研究用發(fā)射波長為800nm 的NIR QDs(NIR QD800) 與RGD 肽段偶聯(lián)，制備NIRQD800-RGD 探針，探討200pmol劑量的NIRQD800-RGD對小鼠行靜脈單次和重復(fù)注射后是否對機體和細胞產(chǎn)生毒性作用，為NIR QD-RGD的進一步研究和向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
QD800抗體連接試劑盒(Q22071MP，Invitrogen公司，美國)，RGD肽段(上海吉爾生化)，總蛋白定量試劑盒(A045-2)、總超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(A001)、谷胱甘肽(GSH) 測試盒(A006-1) 和丙二醛(MDA)測試盒(A003-1) (南京建成生物工程研究所)。紫外分光光度計(DU-600，Beckman公司，美國)，透射電子顯微鏡(H-7500，日立公司，日本)，激光光散射儀(BI-200SM，Brookhaven公司，美國)，活體成像系統(tǒng)(Maestro EX IVIS，CRI 公司， 美國)， 全自動血細胞分析儀(XE2100，Sysmex公司，日本)，全自動生化分析儀(ModularDDP，Roche公司，德國)，冷凍離心機(Z233MK-2，HERMLE公司，德國)，光學(xué)顯微鏡(E100，尼康公司，日本)。
1.2 實驗動物
SPF級雄性BALB/C小鼠33只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量17～20g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，恒溫恒濕條件下飼養(yǎng)，室溫(22±2)℃，空氣濕度(60±10)%，墊料、飼料和飲水均經(jīng)滅菌處理，飼料和水自由攝取。所有實驗操作程序均經(jīng)過重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準。
1.3 QD800-RGD的制備
按照QD800抗體連接試劑盒實驗手冊提供的實驗步驟制備QD800-RGD。①量子點活化和洗脫：濃度為10mmol·L-1的雙功能SMCC溶液預(yù)熱15min (37℃)后取出14μL加入1.5mL的EP管內(nèi)，然后加入濃度為4μmol·L-1的QD800液125μL，均勻混合，在室溫下活化反應(yīng)1h后用NAP-5柱子洗脫反應(yīng)樣本，收集有色的洗脫液約500μL。②RGD的還原和分離：RGD 肽段粉劑溶于300 μL、pH 為7.2～7.4的PBS液中，調(diào)整到濃度為1g·L-1，然后將6.1μL濃度為1mol·L-1的DTT液加入RGD溶液中，混合均勻，室溫下還原反應(yīng)30min后加入20μL染料指示標記液，用NAP-5柱分離反應(yīng)樣本，從洗脫出的第一滴著色樣本開始收集，共收集500μL。③偶聯(lián)和滅活：將以上收集的2種洗脫液混合均勻、室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1h，然后加入濃度為10mmol·L-1的2-巰基乙醇3μL，均勻混合后在室溫下滅活反應(yīng)30min。④濃縮和純化：將1mL以上偶聯(lián)滅活后的樣本加入2個超濾離心裝置管中，每個管0.5 mL，超速離心15 min(7 000r·min-1)，收集各超濾離心膜內(nèi)側(cè)20μL的偶聯(lián)樣本溶液，然后用Pierce柱行色譜分離，得純化的QD800-RGD。最后根據(jù)產(chǎn)品說明書提供的消光系數(shù)和測量波長算出純化的QD800-RGD濃度，其計算公式為：A=εcl(A 為吸光度值，ε為消光系數(shù)，c為分子濃度，l為光程)。
1.4 QD800-RGD和QD800特性檢測
分別各取濃度為16mmol·L-1的QD800-RGD和QD800溶液50μL，用雙蒸水稀釋100倍，超聲震蕩后分別吸取各樣品懸液約50μL滴到有膜的銅網(wǎng)上，靜置10min后用濾紙吸去多余的液體，待干后用透射電子顯微鏡觀察QD800-RGD和QD800的分散性。然后再分別取QD800-RGD和QD800各200μL于樣品池內(nèi)，用超純水稀釋至6mL，密封樣品池后用激光光散射儀檢測QD800-RGD和QD800的流體動力學(xué)直徑。
1.5 QD800-RGD 和QD800在小鼠體內(nèi)分布
SPF級雄性BALB/C 小鼠9只，隨機分為3組，每組3只。Ⅰ組通過尾靜脈注射100μL的QD800-RGD液(含200pmol QD800)，Ⅱ組通過尾靜脈注射100μL (含200pmol)QD800，Ⅲ組通過尾靜脈注射100μL的PBS液。24h后斷頸處死小鼠，立即解剖取出腦、心、肝、脾、肺、腎、脛骨和胃，用PBS沖洗后濾紙吸干，用Maestro EXIVIS行器官的熒光成像檢測(激發(fā)光：630nm;發(fā)射光：800nm)，觀察QD800-RGD和QD800在小鼠以上各器官的'分布。
1.6 各組小鼠全血細胞計數(shù)和血清生化分析
24只SPF級雄性BALB/C小鼠隨機分成4組，每組6只。單次注射組小鼠在第1天通過尾靜脈注射100μL的QD800-RGD (含200pmol QD800);單次注射對照組小鼠在第1 天通過尾靜脈注射100μL的PBS;重復(fù)注射組小鼠分別在第1和7天通過尾靜脈各注射100μL 的QD800-RGD (含200pmol的QD800);重復(fù)注射對照組小鼠分別在第1和7天通過尾靜脈各注射100μL的PBS。每天觀察1次小鼠的一般情況。第14天，將小鼠禁食不禁水12h后摘除眼球采血，每只小鼠取血約1.2mL，分別裝入抗凝采血管和促凝采血管各約0.6mL。用全自動血細胞分析儀檢測抗凝管全血中的白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板、淋巴細胞和中性粒細胞。將促凝管中收集的血液立即離心6min (4℃、3 000r·min-1)分離得到血清，用全自動生化分析儀檢測血清中總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶和血尿素氮。
1.7 各組小鼠臟器系數(shù)
24只小鼠取血后，立即脫臼處死，稱體質(zhì)量，然后解剖取出肝、脾、腎和肺，用濾紙吸干臟器表面的體液和血液后用電子天平稱質(zhì)量，小鼠的臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。
1.8 各組小鼠肝、脾、腎和肺組織中氧化和抗氧化指標的檢測
24只小鼠的器官稱質(zhì)量后，立即將肝、脾、腎和肺切分為2塊，將各器官的其中一塊用4℃ 生理鹽水沖洗3次，濾紙吸干后準確稱質(zhì)量，按器官質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿3min，將勻漿液低溫離心10 min (4℃、3 000r·min-1)，分別各取上清液用考馬斯亮藍法檢測各勻漿液的總蛋白濃度。然后用總SOD測試盒、GSH測試盒和MDA試劑盒分別測定肝、脾、腎和肺組織中的總SOD、GSH 活性和MDA含量，實驗嚴格按測試盒說明書進行。
1.9 各組小鼠組織病理學(xué)檢查
將另一塊肝、脾、腎和肺組織用4%多聚甲醛固定6h后行常規(guī)石蠟包埋，切割為4μm 厚的組織切片，HE染色后采用光學(xué)顯微鏡觀察組織病理學(xué)變化。
1.10 統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。全血中的白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板、淋巴細胞和中性粒細胞，血清中總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶和血尿素氮，器官體質(zhì)量系數(shù)，總SOD、GSH活性和MDA含量均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。
2 結(jié) 果
2.1 QD800-RGD和QD800特性
本實驗獲得的QD800-RGD濃度為1.2μmol·L-1。電子顯微鏡下顯示：QD800-RGD 和QD800均有良好的分散性，均未發(fā)生團聚。QD800-RGD和QD800的平均流體動力學(xué)直徑分別為(23.83±5.24)和(16.67±3.81)nm。
2.2 QD800-RGD和QD800在小鼠體內(nèi)分布
經(jīng)小鼠尾靜脈注射QD800-RGD和QD800 24h后，在小鼠肝、脾和肺內(nèi)可以檢測到明顯的QD800熒光信號存在，腦、心、腎、脛骨和胃內(nèi)未見明顯的QD800熒光信號，表明QD800-RGD和QD800靜脈注射后在體內(nèi)器官的分布相似。
2.3 各組小鼠的一般情況
各組小鼠均存活，進食、進水正常，大、小便正常，無舉尾、無皮膚及毛發(fā)的顏色改變，無行動異常、無興奮和抑制反應(yīng)。
2.4 各組小鼠臟器系數(shù)
QD800-RGD和PBS分別行單次和重復(fù)靜脈注射后各組小鼠的肝、脾、腎和肺的臟器系數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)
2.5 各組小鼠全血細胞計數(shù)
4組小鼠外周血中白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板、淋巴細胞和中性粒細胞檢測結(jié)果見表2。4組小鼠的各血細胞計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
2.6 各組小鼠血清生化指標
4組小鼠血清生化指標檢測結(jié)果見表3。各組小鼠血清中總蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白比值、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶和血尿素氮比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
2.7 各組小鼠肝、脾、腎和肺中SOD、GSH 活性和MDA含量
4組小鼠肝、脾、腎和肺組織中的SOD、GSH 活性和MDA含量檢測結(jié)果見表4。4組小鼠各器官的SOD、GSH 活性和MDA 含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
2.8 各組小鼠組織病理學(xué)檢查
HE染色結(jié)果顯示：單次和重復(fù)靜脈注射QD800-RGD組小鼠肝、脾、腎和肺組織均無壞死，細胞形態(tài)、數(shù)量及分布與對照組比較無明顯差異。
3 討 論
本研究采用的QD800為核-殼納米結(jié)構(gòu)，是以CdSeTe為核，ZnS為殼，外面連接末端帶氨基的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)為外涂層。影響QDs毒性的因素很多，不同類型功能化QDs的毒性作用差異很大。有研究報道：QDs通過靜脈進入體內(nèi)后首先與血液中的成分相互作用，引起多種炎癥和血液因子(如白細胞、血小板和紅細胞等) 的改變。以往的研究證明：150～200pmol劑量的NIR QD-RGD 對體質(zhì)量為20～25g的小鼠行靜脈注射能達到對腫瘤的可視化成像。本研究對體質(zhì)量為17～20g的每只小鼠行單次和重復(fù)靜脈注射200pmol的QD800-RGD，每次注射劑量均超過QD800-RGD達到醫(yī)學(xué)應(yīng)用目的的最大劑量，結(jié)果表明：QD800-RGD單次和重復(fù)靜脈注射14d后均未對小鼠產(chǎn)生血液學(xué)毒性作用。
目前研究認為：QDs產(chǎn)生毒性作用的機制是量子點釋放的重金屬離子(如Cd2+、Se2- 等)和QDs進入體內(nèi)后可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生活性氧自由基，從而對細胞產(chǎn)生毒性作用。本實驗結(jié)果和以往的研究均證明：QD800-RGD靜脈注射后主要分布于肝、脾和肺，由于腎是體內(nèi)排泄器官，因此本研究重點觀察QD800-RGD進入體內(nèi)后對肝、脾、肺和腎的毒性作用。血清中的蛋白(如總蛋白、白蛋白)和一些獨特的酶(天門冬氨酸氫基轉(zhuǎn)換酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶)及血尿素氮的水平是反映肝、腎功能的重要指標，當肝、腎器官發(fā)生炎癥或損傷時以上指標會發(fā)生顯著性變化。本研究結(jié)果表明：小鼠單次和重復(fù)靜脈注射200pmol的QD800-RGD后未產(chǎn)生肝腎功能的損害。
活性氧自由基與細胞的增殖、分化和凋亡等多種生理及病理現(xiàn)象密切相關(guān)，活性氧自由基的增多可引起脂質(zhì)過氧化損傷，引起細胞膜破損，進而導(dǎo)致細胞凋亡或死亡。MDA 是細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中最具代表性的產(chǎn)物，其含量的多少可代表機體脂質(zhì)過氧化的速率和強度，同時細胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生與清除是由多種酶組成的氧化還原系統(tǒng)完成的，SOD和GSH 是細胞內(nèi)清除活性氧自由基的2種關(guān)鍵酶，因此MDA、SOD和GSH 常被作為研究機體氧化應(yīng)激和抗氧化防御的指標。本研究結(jié)果表明：單次和重復(fù)靜脈注射200pmol的QD800-RGD 未導(dǎo)致小鼠肝、脾、腎和肺組織中的SOD、GSH 活性和MDA 含量的顯著改變;同時組織病理學(xué)檢查也證明：單次和重復(fù)靜脈注射QD800-RGD后也未導(dǎo)致小鼠肝、脾、腎和肺的細胞損傷或壞死。
綜上所述，功能化的QDs種類多樣，其毒性作用差異很大，對不同種類功能化的QDs的生物毒性需要進行個體化的評價。本實驗首次證明：QD800-RGD在達到醫(yī)學(xué)成像所需的劑量下重復(fù)靜脈注射，在小鼠體內(nèi)未導(dǎo)致明顯的急性毒性作用，為QD800-RGD的進一步研究和向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供了重要依據(jù)。需要進一步研究的問題是：由于QDs進入體內(nèi)的毒性與劑量有密切關(guān)系，需要進一步研究確定機體毒性與QD800-RGD的劑量的依賴性關(guān)系;QD800-RGD進入體內(nèi)后的長期毒性作用以及具體代謝過程。
【詳談RGD肽段連接的近紅外量子點對小鼠的毒性作用論文】相關(guān)文章：
黃精對小鼠抗衰老作用的研究論文05-23
詳談自噬在腦缺血性損傷中的作用論文10-01
烏藥不同提取物對小鼠胃腸運動調(diào)節(jié)作用的實驗討論論文11-02
紅外熱像儀的測溫原理論文06-25
鋼筋連接施工的論文04-28
紅外與藍牙差異性探析論文05-26