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過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)的測(cè)定
一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br/>
1. 了解米氏常數(shù)的測(cè)定方法
2. 學(xué)習(xí)提取生物組織中的酶
二、 實(shí)驗(yàn)原理
1. 米氏反應(yīng)動(dòng)力學(xué)
米氏方程
(Michaelis-Menten Equation):
2. 米氏常數(shù)的意義：
① 反映酶的種類：Km是一種酶的特征常數(shù)，只與酶的種類有關(guān)，與酶濃度、
底物濃度無(wú)關(guān)，過(guò)氧化氫酶米氏常數(shù)。
�、� 米氏常數(shù)是酶促反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度Vmax一半時(shí)的底物濃度。其數(shù)值大
小反映了酶與底物之間的親和力：Km值越大，親和力越弱，反之Km值越小，親和能力越強(qiáng)。
③ Km可用來(lái)判斷酶（多功能酶）的最適底物：Km值最小的酶促反應(yīng)對(duì)應(yīng)底物
就是該酶的最適底物。
3.米氏常數(shù)的求法：
該作圖法應(yīng)用最廣。但在低濃度是v值誤差較大，在等差值實(shí)驗(yàn)時(shí)作圖點(diǎn)較
集中于縱軸。因此在設(shè)計(jì)底物濃度時(shí)，最好將1/配成等差數(shù)列，這樣可使點(diǎn)距較為平均，再配以最小二乘回歸法，就可以得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果。
此法優(yōu)點(diǎn)是橫軸上點(diǎn)分布均勻，缺點(diǎn)是1/v會(huì)放大誤差，同時(shí)對(duì)底物濃度的選擇有要求。<
4.氧化酶：生物體內(nèi)重要的三種氧化酶類，其作用均是消除體內(nèi)自由基： ①POD：過(guò)氧化物酶
�、赟OD:超氧化物歧化酶
�、跜AT：；過(guò)氧化氫酶
5.過(guò)氧化氫酶的作用：
植物體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使過(guò)氧化氫發(fā)生積累。過(guò)氧化氫可進(jìn)行一步生成氫氧自由基。氫氧自由基是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧，可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，并且有非常高的速度常數(shù)，破壞性極強(qiáng)，可使細(xì)胞膜遭受損害，加速細(xì)胞的衰老和解體。過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）可以清除過(guò)氧化氫、分解氫氧自由基，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的正常生活，因此CAT是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一，其活性高低與植物的抗逆性密切相關(guān)。
6.過(guò)氧化氫酶活力的測(cè)定方法：
①紫外吸收法：
過(guò)氧化氫在240nm波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過(guò)氧化氫酶能分解過(guò)氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度（A240nm）隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光度的變化速度即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶的活性。（以一分鐘內(nèi)A240nm下降0.1為一個(gè)單位）
②滴定法（高錳酸鉀法、碘量法）
在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過(guò)量）的過(guò)氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過(guò)氧化氫。根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)消耗的過(guò)氧化氫的量即可測(cè)出過(guò)氧化氫酶活力大小。
7.實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng) ：
H2O2被過(guò)氧化氫酶分解出 H2O 和 O2 , 未分解的 H2O2 用 KMnO4 在酸性環(huán)境中滴定, 根據(jù)反應(yīng)前后的濃度差可以算出反應(yīng)速度:
酶
2H2O2 ?→ 2H2O + O2
2KMnO4+5H2O2+3H2SO4 ?→ 2MnO4+K2SO4+8H2O+5O2
（本實(shí)驗(yàn)以馬鈴薯提供過(guò)氧化氫酶）
三、 實(shí)驗(yàn)試劑
1. 0.02mol/L 磷酸緩沖溶液 (pH=7.0): 實(shí)驗(yàn)室提供.
2. 酶液: 稱取馬鈴薯 5g, 加緩沖液 10mL, 勻漿過(guò)濾.
3. 0.01mol/L 高錳酸鉀.
4. 0.098mol/L H2O2.
5. 25%H2SO4.
四、 實(shí)驗(yàn)操作
取 6 只錐形瓶, 按下表的順序加入試劑.
先加好過(guò)氧化氫和蒸餾水, 加酶液后立即混合, 依次記錄各瓶的起始反應(yīng)時(shí)間. 反映到達(dá) 5min 立即加入2ml 25%硫酸終止反應(yīng), 充分混勻.。用 0.01mol/L 的 KMnO4溶液滴定瓶中剩余的過(guò)氧化氫至微紅色, 記錄消耗的高錳酸鉀體積.。
五、注意事項(xiàng)：
1.反應(yīng)時(shí)間必須準(zhǔn)確。
2.酶濃度須均一，若酶活力過(guò)大，應(yīng)適當(dāng)稀釋。
3.滴定終點(diǎn)的判定。
六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
過(guò)氧化氫濃度：0.098mol/L
稱取馬鈴薯的質(zhì)量：5.00g
米氏常數(shù)Km= -0.1913
七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：
1.曲線上少一個(gè)點(diǎn)的原因：
用移液管移取序號(hào)為2的過(guò)氧化氫溶液（應(yīng)為1.25ml）錯(cuò)誤的移取了1.75ml，故在制圖時(shí)將其舍去。
2.曲線線性較好（R2=0.9988）的原因：
本實(shí)驗(yàn)采取了兩人分工的方法完成實(shí)驗(yàn)，控制反應(yīng)結(jié)束及滴定分別由一人完成，所以標(biāo)準(zhǔn)都相同，從而在一定程度上提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
3. Km計(jì)算結(jié)果呈負(fù)值的原因：
Km呈負(fù)值（即整條直線都向下移動(dòng)），亦即所有測(cè)定的v值都偏大。
由v=(c1*V1-2.5*c2*V2)/5，故推斷最可能的原因是V2整體測(cè)量偏小，可能的操作失誤是編號(hào)為0的空白對(duì)照組中高錳酸鉀的滴加量偏高，從而使除去該點(diǎn)的整體的高錳酸鉀量都偏小。
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