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研究結(jié)核分枝桿菌中自噬的作用論文
從酵母菌到人類，自噬是一種廣泛存在的生物代謝過程。早期認(rèn)為，自噬是宿主細(xì)胞在饑餓條件下通過降解受損或衰老的細(xì)胞器/蛋白質(zhì)來補充營養(yǎng)物質(zhì)。除了物質(zhì)再循環(huán)，自噬在各種生理和病理生理過程中也起著關(guān)鍵作用，如胞質(zhì)成分的清除、細(xì)胞生長、衰老和死亡。此外，自噬也參與協(xié)調(diào)全身的固有免疫、適應(yīng)性免疫和炎癥反應(yīng)。結(jié)核病( tuberculosis，TB) 是由結(jié)核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis，MTB) 引起的慢性細(xì)胞內(nèi)感染，研究表明自噬參與抗MTB 感染的宿主防御應(yīng)答�，F(xiàn)就自噬在宿主抗MTB 感染免疫應(yīng)答中的作用進(jìn)行綜述。
1 自噬的細(xì)胞和分子水平
自噬是真核生物中高度保守的細(xì)胞降解途徑，通過消化降解自身胞質(zhì)成分，實現(xiàn)大分子物質(zhì)的回收利用。自噬可分為3 類: 大自噬、小自噬以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬( chaperonemediatedautophagy，CMA) 。大自噬( 以下稱作自噬) 是將胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器包裹形成自噬小體進(jìn)行降解。自噬可響應(yīng)于各種脅迫狀態(tài)，例如饑餓可上調(diào)自噬，但營養(yǎng)豐富的條件下自噬也具有本底活性。自噬可以是非選擇性( 例如當(dāng)氨基酸不足時) 或選擇性，選擇性自噬包括細(xì)胞器特異性自噬( 線粒體自噬、過氧化物酶體自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬) 和異源性自噬( 清除病原體的途徑)。一系列體外實驗[2]初步闡明了自噬的分子機制，超過30 多種自噬相關(guān)基因( autophagy-related genes，ATG) 蛋白產(chǎn)物參與自噬的信號傳遞與調(diào)節(jié): 類線蟲51 樣蛋白激酶/黏著斑激酶家族相互作用蛋白200 ( Unc-51-like kinase /focaladhesion kinase family interacting protein of 200 kD，ULK/FIP200) /ATG101 /ATG13 蛋白激酶復(fù)合物，Vps34 /beclin-1 /Vps15 /ATG14 脂質(zhì)激酶復(fù)合物，這2 種復(fù)合物相互作用產(chǎn)生富含磷脂酰肌醇三磷酸( phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3) 的吞噬泡; 2 種泛素樣蛋白綴合系統(tǒng)( conjugationsystem) : ATG5 /ATG12 /ATG16 復(fù)合物和ATG8 /微管相關(guān)蛋白1輕鏈3( microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)，膜結(jié)合的ATG8 為自噬體膜特異性表達(dá)，常被用作自噬的檢測手段。
2 MTB 的生存策略
MTB 是結(jié)核病致病病原菌，MTB 的特征是高感染率和低根除率。MTB 通過阻斷吞噬體合成和成熟從而使MTB 在感染的巨噬細(xì)胞中長期生存。MTB 使用多種策略避免被殺滅:溶解并從吞噬體逃脫，修飾吞噬體阻礙其成熟，甚至在酸性/被降解的吞噬體中長期生存。自噬是宿主防御MTB 的有效途徑之一，自噬可直接消滅胞內(nèi)MTB，從而限制MTB 的生長。細(xì)菌感染可誘發(fā)宿主細(xì)胞內(nèi)形成雙層膜室( 稱為自噬體) ，并同溶酶體融合，降解吞噬的病原體。有研究揭示某些細(xì)菌能抑制誘導(dǎo)自噬的信號傳遞，干擾自噬機制來逃逸或阻止溶酶體和自噬體的融合，利用宿主蛋白掩飾自身以避免被識別，甚至有些細(xì)菌主動利用自噬組件來促進(jìn)自身在細(xì)胞內(nèi)生存生長。MTB 可通過激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白( mammalian target ofrapamycin，mTOR) 依賴的Wnt /SHH( Hedgehog 的同源基因，Sonic Hedgehog) 信號通路抑制γ 干擾素( interferon γ，IFN-γ)介導(dǎo)的自噬。
3 自噬抗結(jié)核感染中的作用
自噬作為固有免疫和適應(yīng)性免疫通路的下游效應(yīng)之一，在抗MTB 感染的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著不可或缺的作用: 傳遞Toll 樣受體( Toll-like receptors，TLR) 等固有免疫受體信號，協(xié)同細(xì)胞因子發(fā)揮防御作用，調(diào)節(jié)免疫相關(guān)GTP 酶( immunityrelated GTPase，IRG) 途徑，增強抗原提呈和影響T 細(xì)胞的穩(wěn)__態(tài)等。多條宿主防御MTB 的免疫通路激活自噬，現(xiàn)初步明確抗MTB 自噬的亞細(xì)胞定位和誘導(dǎo)機制。
3. 1 自噬是病原體相關(guān)分子模式( pathogen-associatedmolecular patterns，PAMP) 調(diào)控的效應(yīng)器模式識別受體( pattern recognition receptors，PRR) 主要表達(dá)于固有免疫細(xì)胞胞膜表面或細(xì)胞質(zhì)中，一種PRR 可識別一種或多種PAMP，其中Toll 樣受體是宿主識別病原微生物( 包括MTB) 激活固有免疫防御機制的關(guān)鍵啟動點。目前為止，共發(fā)現(xiàn)10 個人類TLR 和12 個小鼠TLR。參與識別MTBPAMP 的TLR 主要有: TLR2 ( 與TLR1 /TLR6 形成異源二聚體) 、TLR4 以及TLR9( 識別MTB 的DNA) 。這些TLR 同樣參與到抗MTB 的自噬信號通路中，TLR 信號調(diào)節(jié)固有免疫防御的啟動和發(fā)展，通過與細(xì)胞自噬通路合作消除胞內(nèi)MTB�？咕氖菢O為重要的針對MTB 的免疫防御物質(zhì)。MTB表面的脂蛋白可以刺激人類巨噬細(xì)胞TLR2 /TLR1，產(chǎn)生抗菌肽，增強維生素D 受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和提高細(xì)胞自噬活性，促進(jìn)自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體殺滅細(xì)菌。TLR 信號介導(dǎo)的自噬信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，大致可分為髓樣分化因子88( myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88) 非依賴性和MyD88 依賴性。脂多糖( lipopolysaccharide，LPS) 是TLR4 的配體，刺激巨噬細(xì)胞可增強MTB 吞噬體與自噬體的共定位，LPS 誘導(dǎo)的自噬是MyD88 非依賴性，依賴于TLR4 /含有TIR 結(jié)構(gòu)域的誘導(dǎo)干擾素β 的接頭蛋白/受體相互作用蛋白1 /p38 絲裂原活化蛋白激酶( TLR4 /TIR domain-containingadaptor protein / receptor interacting protein 1 /p38 mitogenactivatedprotein kinases，TLR4 /TRIF/RIP1 /p38MAPK) 信號途徑，同自噬引起的細(xì)胞凋亡通路不同，這條通路并不影響細(xì)胞生存。刺激TLR7 可通過MyD88 依賴性途徑誘導(dǎo)自噬殺滅胞內(nèi)MTB，beclin 1 ( 酵母ATG6 同系物) 和Atg5 參與其中。然而，TLR7 并不識別MTB 病原體相關(guān)分子模式，但仍能加強宿主細(xì)胞對胞內(nèi)MTB 的清除作用。其他不參與到MTB 的識別作用的PRR 介導(dǎo)自噬的研究也證實了這點。因此即使靶病原體組分不是特定TLR 的配體，但增強其介導(dǎo)的自噬活性仍然能加強對病原體的清除，眾多TLR 和其配體激活的自噬在消除胞內(nèi)MTB 中發(fā)揮重要作用。
3. 2 自噬協(xié)同細(xì)胞因子發(fā)揮炎癥作用細(xì)胞因子在宿主防御MTB 中起到重要作用: Th1 細(xì)胞因子IFN-γ、腫瘤壞死因子α( tumor necrosis factor α，TNF-α) 和白細(xì)胞介素12( interleukin 12，IL-12) 在抵御MTB 中發(fā)揮著作用，Th2 細(xì)胞因子IL-4 的水平，與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。一系列細(xì)胞因子和自噬相關(guān)的研究表明，Th1 細(xì)胞因子活化自噬，而Th2 細(xì)胞因子抑制自噬。IFN-γ 對宿主抗MTB 至關(guān)重要，在小鼠中，IFN-γ 介導(dǎo)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶( inducible nitric oxide synthase，NOS2) 通過生產(chǎn)NO 抑制MTB 的生存，同時激活自噬來克服MTB 引起的吞噬體成熟障礙。對TNF-α 誘導(dǎo)的自噬抗MTB 的機制研究則更為深入，TNF-α 通過阻斷蛋白激酶B ( proteinkinase B，Akt) 導(dǎo)致mTOR 的失活從而促進(jìn)細(xì)胞自噬水平，AGT4 和活性氧( reactive oxygen species，ROS) 參與其中。IL-4 和IL-13 是兩種典型的Th2 細(xì)胞因子，可以抑制NO 的產(chǎn)生，衰減巨噬細(xì)胞對胞內(nèi)MTB 的殺滅能力。體外實驗中，IL-4 和IL-13 拮抗自噬以及其對MTB 的殺滅作用。IL-4和IL-13 抑制饑餓誘導(dǎo)的自噬是通過依賴Akt 信號通路，然而Akt 信號并不參與IFN-γ 誘導(dǎo)的自噬�？棺允尚�(yīng)蛋白Bcl-2和Bcl-XL 參與IL-4 和IL-13 介導(dǎo)的抑制自噬作用，機制是Bcl-2 和Bcl-XL 可以同beclin 1 直接結(jié)合，從而阻斷自噬的進(jìn)程�？偟膩碚fAkt 信號參與到抑制饑餓誘導(dǎo)的自噬，而STAT6 信號途徑參與到抑制通路IFN-γ 誘導(dǎo)的自噬。IL-10和IL-6 也被發(fā)現(xiàn)能夠抑制自噬，在MTB 感染的THP-1 細(xì)胞中，IL-6 通過降低ATG12 /ATG5 復(fù)合物的表達(dá)，阻礙自噬體的合成而發(fā)揮抑制效應(yīng)。MTB 可以上調(diào)IL-6 的生產(chǎn)，抑制自噬，以維持自身的生存，mTOR、p38MAPK 和c-Jun 氨基末端激酶( c-Jun N-terminal kinase，JNK) 信號通路參與其中。IL-10 抑制雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬作用依賴Akt 和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3/6( signal transducer and activator of transcription 3/6，STAT3/6) 途徑，而拮抗饑餓誘導(dǎo)的自噬是依賴于1 型磷脂酰肌醇3-激酶( phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K) /Akt 信號，小鼠巨噬細(xì)胞中，也觀察到IL-10 抑制LPS 誘導(dǎo)的自噬作用。阻斷自噬將抑制TNF-α 的分泌，增強促炎分子( 如IL-1β 等)的產(chǎn)生，激活自噬能夠促進(jìn)TNF-α 誘導(dǎo)的核因子κB( nuclear factor-Kappa B，NF-κB) 活化和細(xì)胞間黏附分子1( intercellular adhesion molecular 1，ICAM-1) 的表達(dá)，這表明細(xì)胞因子同自噬條件作用或許是相互的。
3. 3 IRG 參與自噬的抗菌作用在對IFN-γ 誘導(dǎo)自噬抗MTB 的精確機制研究中，發(fā)現(xiàn)IRG 參與其中。在小鼠研究中證實IFN-γ 的刺激使包含MTB的吞噬體能夠募集免疫相關(guān)GTP 酶M1 ( immune-relatedGTPase M1，IRGM1)，Irgm1 是小鼠IRG 家族的一個成員。Irgm1 對吞噬體的作用機制仍然是模糊的，甚至Irgm1 對自噬的影響可能是雙面的，一方面同IFN-γ 協(xié)同作用，以促進(jìn)抗菌響應(yīng)，另一方面Irgm1也負(fù)調(diào)節(jié)IFN-γ 介導(dǎo)的自噬，限制免疫細(xì)胞的自噬效應(yīng)。人類基因組中有3 種IRG 旁系同源物，即IRGC、IRGQ和IRGM，但是只有IRGM 是有功能的。該IRGM 基因位于染色體5q33. 1，且有5 個外顯子。第一外顯子較長編碼181 個氨基酸; 4 個較短的外顯子從所述第一外顯子向下游延伸超過50 000 bp 。多項分子流行病學(xué)研究表明IRGM基因的啟動子區(qū)域的變化，顯示出與MTB 感染的風(fēng)險增加有關(guān)。結(jié)核病易感性同IRGM 多態(tài)性有關(guān)，并與多種參與調(diào)節(jié)自噬過程的其他基因關(guān)聯(lián)。然而，包括宿主的種族、MTB 的種屬和地理環(huán)境等多種因素均可影響MTB 敏感性。因此需要更多的研究( 包括體內(nèi)模型) ，才能正確評估自噬相關(guān)基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性之間的關(guān)系。
3. 4 自噬在抗原提程和T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中的作用T 細(xì)胞通過監(jiān)測由抗原提呈細(xì)胞提呈的抗原肽來調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答作用。主要組織相容復(fù)合體( major histocompatibilitycomplex，MHC) Ⅱ類分子提呈的抗原由CD4 + T 細(xì)胞識別。自噬能間接或直接增強MHCⅡ類分子對抗原的呈遞作用，在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中TLR7 和TLR9 等有效的上調(diào)由卡介苗抑制的MHCⅡ表達(dá)，自噬可以協(xié)同TLR 免疫效應(yīng)增強抗原特異性CD4 + T 細(xì)胞的活化。此外，在感染了MTB 的小鼠巨噬細(xì)胞和CD11 + 樹突狀細(xì)胞表面，用雷帕霉素上調(diào)的自噬能夠直接增加MTB 分泌抗原Ag85B 抗原遞呈。自噬除了通過影響抗原呈遞調(diào)控T 細(xì)胞應(yīng)答外，能直接作用T 細(xì)胞，包括調(diào)節(jié)T 細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、活化和死亡。在胸腺T 細(xì)胞中，從雙陰性到單陽性細(xì)胞發(fā)展的各個階段，均檢測到自噬活性。自噬對胸腺祖細(xì)胞的生存是必要的，Atg5缺陷的人重組激活基因2( recombinant human activated gene 2，RAG2) 和beclin1 基因缺陷的RAG1 - / - 嵌合體存在大大降低了胸腺細(xì)胞的總數(shù)。外周T 細(xì)胞中也顯示出自噬的本底水平，T 細(xì)胞受體( T cell receptor，TCR) 配體的激活可以上調(diào)這種水平。在激活的Jurkat T 細(xì)胞中，NF-κB 介導(dǎo)的beclin1基因表達(dá)上調(diào)，支持了TCR 配體激活的自噬可以增加beclin1的表達(dá)。磷脂酰肌醇3 激酶催化亞基3 型( phosphatidylinositol3-kinase，catalytic subunit type 3，Vps34 ) /beclin1 復(fù)合物在T 細(xì)胞調(diào)控自噬的作用是矛盾的結(jié)果。在一項研究中，Vps34 缺陷的T 細(xì)胞保有自噬活性，但表現(xiàn)出IL-7 受體的缺失，從而降低細(xì)胞的存活。然而在不同的基因敲除模型，顯示Vps34 對激活T 細(xì)胞中的自噬是必須的。因此T 細(xì)胞中自噬的活化可能存在2 種途徑即Vps34 /beclin1 依賴的經(jīng)典途徑和非依賴Vps34 /beclin1 途徑。
4 自噬相關(guān)的抗MTB 治療及展望
自噬與MTB 感染有著復(fù)雜的相互作用，深入的體內(nèi)外研究為將抗MTB 藥物帶來新的見解。自噬的治療意義為臨床研究提供新的策略: 完善抗結(jié)核化療傳統(tǒng)方案，老藥新用，將免疫治療與自噬相結(jié)合等。例如，常用的抗結(jié)核藥物異煙肼和吡嗪酰胺能夠促進(jìn)自噬的激活。雷帕霉素( mTOR 抑制劑) 能夠引起mTOR 信號介導(dǎo)的自噬，在巨噬細(xì)胞的研究中表明，高劑量雷帕霉素能夠有效殺滅分枝桿菌，然而低劑量的mTOR 抑制劑效果不明顯。他汀類藥物是常用的降膽固醇藥物，它們也可以影響免疫應(yīng)答。他汀類藥物治療通過促進(jìn)自噬和吞噬體成熟從而殺滅人類和小鼠巨噬細(xì)胞中的結(jié)核桿菌。雷帕霉素、他汀類藥物或維生素D等藥物可能會通過誘導(dǎo)自噬提高M(jìn)TB 的治療但長期或過量的自噬能增加細(xì)胞死亡，通過激活自噬來改善結(jié)核病治療的最佳方式需要進(jìn)一步研究。DNA 疫苗是很有前途的新一代疫苗，可以通過DNA 編碼目的抗原引發(fā)特異性免疫應(yīng)答。抗MTB Ag85B DNA 疫苗的研究中，與細(xì)胞自噬相結(jié)合的DNA疫苗療法能顯著增強Th1 型細(xì)胞因子( IFN-γ 和IL-2) 表達(dá)和CD4 + T 細(xì)胞免疫效應(yīng)，利用自噬途徑或許代表了抗MTB疫苗接種一個新興的方向。研究MTB 免疫機制和ATG 蛋白質(zhì)之間的相互作用一直是近年來研究的主要焦點，大量的研究將使人們更好地理解細(xì)菌逃逸自噬的機制，并將其用于治療MTB 感染的未來藥物設(shè)計中。
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