SchB對(duì)UVA損傷HaCat保護(hù)作用的討論論文
隨著大氣臭氧層的破壞，紫外線對(duì)人體皮膚的損傷也越來越嚴(yán)重，主要包括長波紫外線(UVA，320～340 nm)和中波紫外線(UVB，290～320 nm)。UVA對(duì)皮膚的損傷程度高于UVB，其會(huì)導(dǎo)致皮膚真皮組織中的膠原及彈力纖維降解、皮膚光敏反應(yīng)發(fā)生、皮膚免疫功能降低及皮膚腫瘤形成。五味子乙素(SchB)可抑制大鼠肝臟質(zhì)膜中丙二醛(MDA)的增加[4]，維持細(xì)胞在氧化損傷狀態(tài)下的穩(wěn)定性。在四氯化碳引起大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的模型中，SchB可使肝細(xì)胞MDA、乳酸脫氫酶(LDH)及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)釋放減少，肝細(xì)胞的存活率明顯提高。SchB還可減輕過氧化氫(H2O2)對(duì)心肌細(xì)胞的氧化損傷，表現(xiàn)為MDA及LDH降低，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性增高。但SchB在皮膚抗老化方面的研究較少。本研究旨在研究SchB是否對(duì)UVA照射后的永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCat細(xì)胞)有保護(hù)作用，并對(duì)其保護(hù)機(jī)制進(jìn)行探討。
1 材料與方法
1.1 主要儀器和試劑
NikonTS-100倒置顯微鏡;臺(tái)式紫外線輻射儀(上海，Sigma公司);SW-CJ-2FD型雙人單面凈化臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;MCO-AC 型CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱，SANYO公司;多功能酶標(biāo)儀，Thermo Scientific公司。DMEM液體培養(yǎng)基為天潤善大公司產(chǎn)品;胎牛血清(FBS)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司;二甲基亞砜(DMSO)考馬斯亮藍(lán)G250為FLUKA公司產(chǎn)品;胰酶(Trypsin)、DMSO購于GIBECO公司。SchB相對(duì)分子質(zhì)量400，由天津武警后勤醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室陳虹教授研究室提供，體外實(shí)驗(yàn)用DMSO配制。
1.2 實(shí)驗(yàn)分組及照射方法
將盛有傳代HaCat細(xì)胞的培養(yǎng)瓶放入5%CO2孵箱中培養(yǎng)，10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)，每天換液。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組(不經(jīng)UVA照射)、模型組(UVA照射劑量為1、5、10、15 J/cm2)及ShcB 1~4組(UVA照射后分別加入ShcB 0.1、0.01、0.001、0.000 1 μmol/L)。UVA 波長為320～400 nm，照射距離為1 cm。倒去各組的細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗2次，再加入適量的冷PBS覆蓋，照射后加入無血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，通過檢測細(xì)胞存活率來確定合適的照射強(qiáng)度。采用合適強(qiáng)度UVA處理HaCat細(xì)胞，給予不同濃度的SchB處理UVA損傷后的HaCat細(xì)胞。
1.3 噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)
取對(duì)數(shù)生長期HaCat細(xì)胞，胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1.5×105個(gè)/mL，每孔100 μL的細(xì)胞懸液加入96孔板中，培養(yǎng)36 h后做UVA處理，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。ShcB組UVA照射2 h后加入不同濃度SchB。所有研究組繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入50 μL 的MTT，37 ℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)4 h后，加DMSO 4 h，在震蕩儀上震蕩4 min后在酶標(biāo)儀550 nm處測定光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率=1-(對(duì)照組OD值-模型組OD值)/對(duì)照組OD值。
1.4 氧化損傷實(shí)驗(yàn)
取對(duì)數(shù)生長期HaCat細(xì)胞，胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×105個(gè)/mL，鋪到10 cm的'培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，設(shè)對(duì)照組、模型組、ShcB 1~4組，放入5%CO2孵箱中，培養(yǎng)36 h后，用5 J/cm2的UVA照射2 h，ShcB 1~4組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取上清液酶生化法測定細(xì)胞外的GSH-Px、雙氧化物歧化酶(SOD)、LDH和NO的含量。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用xˉ±s 表示，各組之間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 UVA實(shí)驗(yàn)照射劑量的確定對(duì)照組和1、5、10、15 J/cm2模型組HaCat細(xì)胞的存活率分別為(100.00±6.31)%、(98.10±5.78)%、(75.05±8.64)%、(66.10±5.61)%和(53.71±2.59)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.805，P<0.01)。隨UVA照射劑量增大，HaCat細(xì)胞存活率逐漸降低，預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率低于70%時(shí)，再加用SchB時(shí)受損HaCat細(xì)胞幾乎不再增殖，GSH-Px、SOD、LDH、NO幾乎無差別，不符合實(shí)際情況，故選擇5 J/cm2作為實(shí)驗(yàn)照射劑量。
2.2 不同濃度SchB對(duì)UVA損傷后HaCat細(xì)胞的保護(hù)作用SchB 3組細(xì)胞存活率最高，但隨SchB濃度降低，藥物的保護(hù)作用減弱。
2.3 不同濃度SchB 對(duì)HaCat 細(xì)胞GSH-Px、SOD、LDH、NO 含量的影響與對(duì)照組比較，模型組的GSH-Px、SOD 活性降低，LDH、NO 含量升高(P<0.05)。與模型組比較，SchB 1~4組均能提高SOD活性，降低LDH、NO含量，除SchB 4組外，SchB 1~3組均能提高GSH-Px活性。
3 討論
UVA 輻射可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇(ROS)。ROS攻擊細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生更多的ROS，導(dǎo)致皮膚細(xì)胞DNA的光損傷，表現(xiàn)為皮膚的表皮和真皮層的損傷。SchB為五味子中的單體活性成分，其可以清除肝細(xì)胞中的自由基及脂質(zhì)過氧化物，并可提高肝細(xì)胞中抗氧化物酶的表達(dá)。侯微等研究發(fā)現(xiàn)，SchB可以減輕H2O2造成HaCat細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，從而起到一定的保護(hù)作用，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)通過檢測皮膚的保護(hù)性指標(biāo)SOD、GSH-Px的含量和損傷性指標(biāo)LDH、NO的含量發(fā)現(xiàn)，隨著SchB濃度的降低，其對(duì)HaCat 細(xì)胞保護(hù)作用越強(qiáng)，當(dāng)濃度降到0.001 μmol/L時(shí)，保護(hù)作用最強(qiáng)。因此不是SchB濃度越高，保護(hù)作用就越強(qiáng)，0.001 μmol/L的SchB為最適濃度，過高及高低的濃度保護(hù)效果均不佳，原因有待相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)一步分析。
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