- 相關(guān)推薦
pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒的構(gòu)建研究論文
應(yīng)激蛋白Argonaute1是一種多功能蛋白，參與RNA干擾及應(yīng)激顆粒(SGs)、加工體(PBs)形成等多種細(xì)胞生物學(xué)過程。pmCherry-C1是一種可以編碼紅色熒光蛋白的真核表達(dá)載體。2015年9～11月，本研究通過基因工程技術(shù)將Argonaute1基因片段連接至pmCherry-C1載體，構(gòu)建pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒，旨在為深入研究Argonaute1蛋白的細(xì)胞生物學(xué)功能提供便利工具。
1材料與方法
1.1材料質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞:pmCherry-C1載體由JohanPerane博士饋贈(zèng)，感受態(tài)大腸桿菌Trans1購(gòu)自天津科儀嘉欣科技有限公司，HeLa細(xì)胞來自本實(shí)驗(yàn)室。酶類及主要生化試劑:限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4DNA連接酶均購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，Taq酶購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司，T/A載體(pEASY-T1)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，B型小量DNA快速回收試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司，質(zhì)�？焖偬崛≡噭┖匈�(gòu)自北京索來寶科技有限公司，去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Promega公司，Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Pierce公司，LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)于KPL公司�？贵w:兔抗人Argonaute1單克隆抗體購(gòu)自CST公司，鼠抗人G3BP單克隆抗體和兔抗人DCP1α抗體購(gòu)自abcam公司，鼠抗人櫻桃紅蛋白(Cherry)單克隆抗體購(gòu)自MBL公司，藍(lán)色熒光(AlexaFluor350)標(biāo)記的驢抗鼠熒光二抗和綠色熒光(AlexaFluor488)標(biāo)記的驢抗兔熒光二抗購(gòu)自Invitrogen公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠和抗兔IgG二抗購(gòu)自KPL公司。引物合成及基因測(cè)序由北京天一輝遠(yuǎn)公司完成。
1.2pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒構(gòu)建
1.2.1Argonaute1蛋白目的片段獲取提取HeLa細(xì)胞的總RNA，以TGGACCAAAAGGGGCAGCACTGGTGCCC序列進(jìn)行Argonaute1的cDNA擴(kuò)增;根據(jù)CDS序列(NM012199.2)設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物序列，即F:5'-CCGGAATTCCATGGAAGCGGGACCCTCGGGAG-3';R:5'-CGCGGATCCTCAAGCGAAGTACATGGTGCGCA-3';以反轉(zhuǎn)錄的Argonaute1cDNA為模板，擴(kuò)增PCR目的片段，條件為95℃預(yù)變性5min，95℃30s、65℃45s、72℃3min，共15個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)降低1℃，再以50℃進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min;將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，并將目的片段與pEASY-T1(T/A載體)于25℃連接15min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Tran1-T1感受態(tài)細(xì)胞，置于含有氨芐/卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽(yáng)性克隆，搖菌擴(kuò)增并提取質(zhì)粒。以EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，凝膠回收試劑盒回收并純化目的片段。
1.2.2線性pmCherry-C1質(zhì)粒載體獲取以質(zhì)�？焖傩√嵩噭┖刑崛mCherry-C1質(zhì)粒，進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，完整切下呈線性的pmCherry-C1質(zhì)粒載體，以1%瓊脂糖電泳分離，再以凝膠回收試劑盒回收pmCherry-C1線性載體(約4700bp)。在T4DNA連接酶作用下，將線性pmCherry-C1質(zhì)粒載體與具有相同黏性末端的Argonaute1功能片段于22℃下連接并過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌大腸桿菌Trans1，在含有卡那霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽(yáng)性克隆，搖菌擴(kuò)增并提取重組質(zhì)粒。
1.3pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒鑒定
1.3.1酶切及基因測(cè)序采用EcoRⅠ和BamHⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pmCherry-C1-Argonaute1進(jìn)行單、雙酶切鑒定，并以1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證片段大小;同時(shí)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。
1.3.2融合蛋白檢測(cè)采用Westernblotting法。以預(yù)冷的1×NP-40裂解液裂解細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞后4℃、12000r/min離心10min，取上清獲取全細(xì)胞裂解液，以BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。裂解液中加入SDS上樣緩沖液(pH6.8的50mmol/LTris-Cl、2%SDS、0.1%溴酚藍(lán)、10%甘油、2.5%β-巰基乙醇)，99℃熱變性10min，8%SDS-PAGE電泳;以半干轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉3h;加入兔抗人Argonaute1單克隆一抗或鼠抗Cherry一抗，4℃孵育過夜;TBST溶液洗膜3次，每次10min;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG二抗室溫孵育2h;TBST溶液再次洗膜3次，每次10min;加入LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物后暗室曝光。
1.3.3三色熒光共定位分析以去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒。將細(xì)胞接種于激光共聚焦皿中，以含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，進(jìn)行脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48h給予0.5mmol/L亞砷酸鹽處理1h，以4%多聚甲醛室溫固定10min，以高壓過的PBS緩沖液洗滌2次、5min/次。以1%通透液(含0.2%TritonX-100的PBS)室溫靜置通透10min;加入1%BSA封閉1h;加入G3BP(1∶250)和DCP1α(1∶100)一抗混合液，4℃孵育過夜;PBS洗滌3次，10min/次;加入藍(lán)色熒光標(biāo)記驢抗鼠(1∶800)與綠色熒光標(biāo)記驢抗兔(1∶800)二抗混合液，4℃孵育過夜;PBS洗滌3次，10min/次。以不含DAPI的細(xì)胞熒光封片液封片并過夜，以激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)紅、綠、藍(lán)三色熒光信號(hào)。
2結(jié)果
2.1Argonaute1目的片段PCR擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度約為2574bp。
2.2線性pmCherry-C1質(zhì)粒載體完整的線性pm-Cherry-C1質(zhì)粒載體經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后，在4722bp左右出現(xiàn)條帶，純化回收后用于后續(xù)的連接反應(yīng)。
2.3重組真核表達(dá)質(zhì)粒pmCherry-C1-Argonaute1鑒定結(jié)果
2.3.1酶切及基因測(cè)序?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ的單、雙酶切，產(chǎn)生的條帶大小與預(yù)期相符，重組質(zhì)粒基因測(cè)序結(jié)果正確，證明Argonaute1功能片段已成功插入到pm-Cherry-C1的多克隆位點(diǎn)上。
2.3.2融合蛋白表達(dá)Argonaute1蛋白、Cherry蛋白融合后分子量為89.7KDa，Westernblotting法檢測(cè)的蛋白條帶與目的融合蛋白分子量相符，表明Cherry-Argonaute1融合蛋白表達(dá)成功。
2.3.3三色熒光共定位轉(zhuǎn)染構(gòu)建的重組質(zhì)粒pmCherry-C1-Argonaute1，可在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)Cherry-Argonaute1可在胞質(zhì)內(nèi)形成紅色的顆粒狀結(jié)構(gòu)，與SGs的標(biāo)志蛋白G3BP(藍(lán)色)、PBs的標(biāo)志蛋白DCP1α(綠色)顆粒結(jié)構(gòu)均呈共定位關(guān)系。
3討論
Argonaute1蛋白家族是一類相對(duì)分子量約為100KDa的序列保守蛋白，表達(dá)于人、果蠅、擬南芥等多個(gè)物種。Argonaute1蛋白家族包括多個(gè)成員，多含有月牙狀的PAZ和具有潛在核酸內(nèi)切酶活性的PIWI結(jié)構(gòu)域，參與miRNA、siRNA、piRNA等多個(gè)非編碼小RNA的細(xì)胞生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，Argonaute1是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的核心元件，與siRNA生成、靶mRNA降解、細(xì)胞應(yīng)激等過程密切相關(guān)。生物體的生存環(huán)境復(fù)雜多變，機(jī)體細(xì)胞為應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激、滲透壓休克、熱休克、紫外線輻射和病毒感染等多種外界刺激而建立相應(yīng)的“應(yīng)激反應(yīng)體系”，以保持細(xì)胞旺盛的生命力。轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機(jī)制是其中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，它可調(diào)控胞質(zhì)內(nèi)RNA代謝、暫時(shí)抑制應(yīng)激細(xì)胞中蛋白的翻譯過程、節(jié)省細(xì)胞內(nèi)合成代謝的原料和能量、優(yōu)先表達(dá)應(yīng)激所特需的蛋白等。SGs和PBs是細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí)在胞質(zhì)內(nèi)形成的與RNA代謝密切相關(guān)的顆粒狀結(jié)構(gòu)。這兩種顆粒結(jié)構(gòu)實(shí)質(zhì)上是一系列蛋白、核酸的聚集體。隨著研究的深入，不斷有新的應(yīng)激蛋白被發(fā)現(xiàn)。
其中，Argonaute1蛋白同時(shí)參與細(xì)胞中SGs和PBs的形成。通過基因工程的方法對(duì)Argonaute1蛋白進(jìn)行熒光蛋白標(biāo)記，可用于探討Argonaute1蛋白在細(xì)胞應(yīng)激中的作用。Cherry是四聚體Discosomasp.紅色熒光蛋白的一個(gè)突變體，熒光強(qiáng)度及抗光漂白能力均有所提高。pmCherry-C1載體允許目的基因片段插入Cherry蛋白基因的C端，形成紅色熒光標(biāo)記的目的蛋白。本研究通過構(gòu)建pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒的方法對(duì)Argonaute1蛋白進(jìn)行Cherry的熒光標(biāo)記。在Westernblotting實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，利用抗內(nèi)源性Argonaute1抗體可以檢測(cè)出兩個(gè)條帶，而抗Cherry抗體檢測(cè)出一個(gè)條帶，表明pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒能夠在活細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)Cherry與Argonaute1的融合蛋白。當(dāng)細(xì)胞受到亞砷酸鹽氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Cherry標(biāo)記的Argonaute1蛋白可與應(yīng)激顆粒(以G3BP蛋白為標(biāo)記蛋白)和加工體(以DCP1α為標(biāo)記蛋白)均呈共定位關(guān)系，說明Argonaute1蛋白為細(xì)胞應(yīng)激和加工體的共同成員。
總之，本研究成功構(gòu)建了重組pmCherry-C1-Argonaute1質(zhì)粒，其可有效表達(dá)Cherry標(biāo)記的Argonaute1融合蛋白;上述結(jié)果有助于深入研究Argonaute1蛋白在細(xì)胞應(yīng)激及相關(guān)疾病研究領(lǐng)域的生物學(xué)作用機(jī)制。
【pmCherry-C1-Argonaute1重組質(zhì)粒的構(gòu)建研究論文】相關(guān)文章：
后工業(yè)化與性別的重組論文07-27
以生為本構(gòu)建高效課堂論文08-04
研究銀行論文03-07
論文論文《“潛心會(huì)文本”——構(gòu)建務(wù)實(shí)高效課堂的前提》09-26
服務(wù)營(yíng)銷研究論文12-07
教學(xué)研究論文12-13
如何撰寫研究論文09-15
是研究性論文03-07
專題研究論文的具體研究方法04-29