開(kāi)口箭活性部位抗腫瘤細(xì)胞作用研究論文
1 材料與儀器
1.1 細(xì)胞株人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人肝癌細(xì)胞(HepG2)均由三峽大學(xué)分子生物學(xué)研究所提供。
1.2 藥品與儀器RPMI-1640為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品;新生小牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產(chǎn)品;HEPES為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;胰蛋白酶為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品;四氮唑藍(lán)(MTT)為美國(guó)AMRESCO公司產(chǎn)品;環(huán)磷酰胺 (CP,江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號(hào):07020121)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(GENIOS TECAN);CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司);LD4-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);96孔板(美國(guó)Cornning公司)。開(kāi)口箭根莖于2002-07采自湖北省神農(nóng)架林區(qū),經(jīng)三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院陳發(fā)菊副教授鑒定為T(mén)upistra chinensis Bak.,標(biāo)本存放于湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(No.TC200207SNJ)。
2 方法
2.1 藥物制備開(kāi)口箭根莖粉碎后,用甲醇回流提取,合并提取液,濃縮后經(jīng)氯仿脫脂后用水飽和的正丁醇萃取,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇,濃縮液抽干后即得到開(kāi)口箭總皂苷,配成水液,過(guò)大孔樹(shù)脂柱,水洗, 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫,得開(kāi)口箭4部分皂苷。分別取開(kāi)口箭總皂苷、30%開(kāi)口箭皂苷、70%開(kāi)口箭皂苷兩個(gè)樣品,用PBS配制成所需濃度,依次為312.5,625,1 250,2 500,5 000,10 000 μg/ml, 70%開(kāi)口箭皂苷用PBS配制成所需濃度,依次為156.25,312.5,625,1 250,2 500,5 000 μg/ml,所有受試樣品均用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。環(huán)磷酰胺 (CP)用DMSO將其配置為500 mg/ml。
2.2 細(xì)胞培養(yǎng) Hela和HepG2細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液(另加10mmol/L HEPES、2.0 mg/mlNaHCO3、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10%新生小牛血清),于CO2孵箱中37℃,5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。
2.3 開(kāi)口箭活性部位對(duì)Hela和HepG2細(xì)胞殺傷作用最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇MTT法實(shí)驗(yàn)條件的初步優(yōu)化,主要是對(duì)溶解藥物的.溶劑(水、PBS)、加藥前的培養(yǎng)時(shí)間(6,12,24 h)、藥物劑量和細(xì)胞密度進(jìn)行了摸索。其中密度細(xì)胞分別取0.1×105,0.5×105,0.8×105,1×105個(gè)/ml,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種100 μl,轉(zhuǎn)板24 h后加不同濃度的開(kāi)口箭活性部位,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,以MTT法測(cè)定吸光度,比較不同細(xì)胞密度的線性關(guān)系。
2.4 MTT比色法[6]MTT比色法按Mosmann氏法略加改進(jìn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5×105個(gè)/ml,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種100 μl,轉(zhuǎn)板24 h后加100 μl受試藥,另設(shè)陰性對(duì)照組(不加藥)、空白調(diào)零組(只有PBS)和陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺組),每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48 h,吸棄上清后加MTT(5 mg/ml)100 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄去上清液,加DMSO 100 μl,用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值[7],求出IC50。抑制率(%)=[陰性對(duì)照A570- 加藥組A570]/ 陰性對(duì)照A570×100%。
2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分1×106個(gè)細(xì)胞于培養(yǎng)瓶,陰性對(duì)照組0.5×106個(gè)細(xì)胞每瓶,培養(yǎng)24 h;吸棄部分上清后加藥混勻(開(kāi)口箭總皂苷、30%皂苷終濃度2 500μg/ml,70%皂苷和環(huán)磷酰胺終濃度1 250 μg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)48 h;于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,收集上清于相應(yīng)標(biāo)簽離心管中,各加1 ml胰酶消化,加4 ml培養(yǎng)液于該培養(yǎng)瓶中,并一起吸至各相應(yīng)離心管中,各瓶加入5 ml PBS洗滌,洗滌液一起吸入相應(yīng)離心管中,以2 000 r/min離心5 min;吸棄上清,加入1 ml 80%乙醇和0.5 mmol/LEDTA(Na)2的PBS混合液懸起細(xì)胞,輕輕混勻,于4℃固定30 min;棄上清,加PBS 10 ml混勻,以2 000 r/min離心5 min;用500 μl含0.1%TritonX-100 和50 μg/ml RNase的PBS懸起細(xì)胞,轉(zhuǎn)置測(cè)定管中,加溴化丙錠PI 100 μl,避光染色17 min(一般15~20 min);濾膜過(guò)濾后上機(jī)。
3 結(jié)果
開(kāi)口箭活性部位對(duì)Hela和HepG2細(xì)胞殺傷作用最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇為了得到相對(duì)穩(wěn)定并且可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)并結(jié)合大量資料,對(duì)該MTT法實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了初步優(yōu)化,主要是對(duì)溶解藥物的溶劑、加藥前的培養(yǎng)時(shí)間、藥物劑量和細(xì)胞密度進(jìn)行了探索。對(duì)于溶劑,最初采用的溶劑是水,通過(guò)對(duì)照發(fā)現(xiàn)溶解藥物的水對(duì)細(xì)胞的影響很小,但并非沒(méi)有,所以正式實(shí)驗(yàn)采用PBS溶解藥物;對(duì)于加藥前的培養(yǎng)時(shí)間采用了6,12,24 h 3個(gè)時(shí)間,通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)加藥前培養(yǎng)24 h細(xì)胞狀態(tài)良好,由此選用了加藥前培養(yǎng)24 h;
對(duì)于藥物劑量,通過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn),最終選擇了最高濃度開(kāi)口箭總皂苷、30%皂苷為10 000 μg/ml,70%皂苷為5 000 μg/ml,而環(huán)磷酰胺為20 000 μg/ml;對(duì)于細(xì)胞密度,通過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn),采用5種細(xì)胞密度即0.1×105,0.5×105,0.8×105,1×105個(gè)/ml,同樣的藥物濃度情況下,開(kāi)口箭活性部位對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制呈最好線性關(guān)系的細(xì)胞密度是0.5×105 個(gè)/ ml,由此選擇最佳細(xì)胞濃度是0.5×105個(gè)/ml。通過(guò)這些因素的優(yōu)化,從而初步排除了其他非藥物因素對(duì)細(xì)胞的影響;而且這兩種腫瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn)在同一批進(jìn)行實(shí)驗(yàn),排除了不同環(huán)境的干擾,從而得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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