不同基因型青花菜游離小孢子培養(yǎng)的幾個方法分析論文
青花菜( Brassica oleracea var. italica) ，俗名綠菜花。由于其營養(yǎng)價值高，尤其是在抗癌功能上為同類蔬菜之首，深受消費者青睞。我國青花菜品種多為國外引進，種子昂貴。為培育新的種質(zhì)資源，育成優(yōu)質(zhì)青花菜品種，常規(guī)方法需經(jīng)過雜交、回交和自交分離，選育出理想的材料常常需要好幾個世代。而在青花菜育種中利用小孢子組織培養(yǎng)，不僅可快速得到雙單倍體純系，還可大大縮短育種年限[1-4]。自1982年至今，甘藍型油菜小孢子培養(yǎng)獲得胚狀體后，國內(nèi)外利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在蕓薹屬作物上相繼取得成功[5]，1991年Takahata等[6]首次利用青花菜進行了小孢子培養(yǎng)，隨后張德雙等[7]、王春麗[1]等也在青花菜游離小孢子培養(yǎng)上取得了成功。雖然小孢子培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，但很多學者側(cè)重于對小孢子胚胎發(fā)育的誘導因素進行研究，本試驗以5個不同基因型的青花菜為材料，對游離小孢子培養(yǎng)與植株再生進行了研究，旨在完善青花菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)，同時也可為青花菜的遺傳育種提供新的材料。
1 材料和方法
1.1 材 料
供試材料由天津科潤蔬菜研究所提供，供試材料于2012年10月定植于天津市科潤蔬菜所，采取常規(guī)栽培管理，翌年3—4月植株出現(xiàn)花蕾后，選取主花序上的花蕾進行小孢子培養(yǎng)。
1.2 小孢子培養(yǎng)方法
參考張德雙等[7]的研究，取處于單核晚期和雙核早期的花蕾(4.1~5.0 mm)的小孢子進行培養(yǎng)。小孢子的分離、純化培養(yǎng)參考趙前程等[8]的方法，用50 g·L-1質(zhì)量濃度的次氯酸鈉溶液進行表面消毒，經(jīng)無菌水沖洗，用含蔗糖為100 g·L-1的B5培養(yǎng)基進行游離、洗滌，用含蔗糖為130 g·L-1，pH 值5.8，添加6-BA(1 mg·L-1)和NAA(0.1 mg·L-1)的NLN液體培養(yǎng)基進行小孢子培養(yǎng)，并添加一定的活性炭，培養(yǎng)密度為1×105~2×105個·mL-1，熱激后，置25 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)暗培養(yǎng)，利用倒置顯微鏡觀察小孢子發(fā)育進展。
1.3 胚胎發(fā)生與胚培養(yǎng)
小孢子受到熱激后開始細胞分裂，黑暗培養(yǎng)2周左右，肉眼可見胚狀體。30 d左右，胚狀體處于子葉期，轉(zhuǎn)移至添加6-BA(0.2 mg·L-1)和NAA(0.02 mg·L-1)的MS培養(yǎng)基上，形成再生芽。
1.4 植株再生與移植
將小孢子的再生芽在MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，形成完整植株，對試管苗進行增殖培養(yǎng)，擴大植株數(shù)量，加快育種，經(jīng)過馴化移栽到含基質(zhì)的盆缽中，待小植株成活后，移栽至大田，進行管理。
2 結(jié)果與分析
2.1 小孢子離體培養(yǎng)的生長發(fā)育觀察
經(jīng)過熱激的青花菜小孢子逐漸膨大(圖1-A)，2周左右，小孢子從多細胞團結(jié)構(gòu)，逐漸發(fā)育成球形胚(圖1-B)、心形胚(圖1-C)、魚雷胚(圖1-D)和子葉胚(圖1-E)，將子葉胚置于光照下培養(yǎng)5~7 d，可見胚狀體萌發(fā)，10~15 d左右，形成叢壯苗(圖1-F)，利用叢壯苗在MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，7 d左右，可見植株的基部產(chǎn)生大量白色的粗壯的根，形成健壯植株(圖1-G)。
2.2 不同基因型小孢子胚誘導的差異比較
由表1可以看出，供試的`5個材料中，只有兩個形成了小孢子胚，胚胎誘導成功率為40%。不同基因型的小孢子胚誘導成功頻率存在差異，11J-52每花蕾平均產(chǎn)胚數(shù)達到2.1個，而11J-63僅有0.5個。在未出胚的3個基因型中，11J-150和11J-158都觀察到了細胞膨大，11J-173觀察到了細胞分裂，說明它們對培養(yǎng)條件產(chǎn)生了反應，但卻未能繼續(xù)發(fā)育。由此可見，基因型對小孢子胚胎發(fā)育有明顯影響。
2.3 小孢子植株再生
再生植株在花球形成期和開花期存在分離情況見圖2。11J-52和11J-63兩種材料均未采用任何加倍處理，兩份材料產(chǎn)生的再生植株只有少部分植株不能表現(xiàn)出十字形花冠，而呈現(xiàn)出一字型。80%以上的植株可育，并且能正常自交結(jié)角。
3 結(jié)論與討論
利用小孢子培養(yǎng)不僅能夠快速有效地獲得純系植株，加快青花菜的育種進程，而且利用單倍體植株的突變來篩選抗病、抗旱、抗蟲的青花菜植株顯得更加便捷[9]。
基因型是制約小孢子發(fā)育的重要因素[10]。在相同的試驗條件下，不同基因型誘導小孢子發(fā)育的頻率差異很大，本研究中，基因型11J-52達2.1個，而11J-63則僅有0.5個，其他3個基因型(11J-150，11J-158，11J-173)則只有細胞膨大和部分細胞分裂，這個結(jié)果可以為青花菜游離小孢子培養(yǎng)提供理論依據(jù)。但是，關(guān)于小孢子培養(yǎng)的啟動機制、微觀發(fā)育機制、發(fā)育途徑以及與之相關(guān)的生理生化方面的研究仍在探究過程中。
本試驗中同時還發(fā)現(xiàn)高溫熱激可以啟動小孢子分化，但是，熱激又會對小孢子造成一定的傷害，這與一些研究者得出的結(jié)果相類似[11]，如何克服這一傷害，找出最適宜的高溫預處理方式、處理時間與溫度以增加出胚率還有待進一步研究。此外，本試驗獲得的再生植株均通過自然加倍所得，其可能是單倍體、多倍體及非整倍體構(gòu)成的混合群體。試驗中觀察到的具有一字型花冠的再生植株可能是非整倍體。通過小孢子胚產(chǎn)生的再生植株在農(nóng)藝性狀上的差別與植株倍性之間的聯(lián)系還有待研究。
參考文獻:
[1] 王春麗，王濤濤，張余洋，等.青花菜小孢子胚植株再生及倍性研究[J].中國蔬菜，2010(4):36-40.
[2] 方淑桂，陳文輝，曾小玲，等.大白菜游離小孢子培養(yǎng)若干技術(shù)研究初報[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2003，18(2):123-126.
[3] 湯青林，宋明，張鐘靈.甘藍類蔬菜游離小孢子培養(yǎng)研究進展[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2000，13(3):98-103.
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[5] Lichter R.Induction of haploid plant from isolated pollen of brassica napus[J]. Z Pflanzenhysiol，1982，105(5):427-434.
[6] Takahata Y， Keller W A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L[J].Plant Science，1991，74:235-242.
[7] 張德雙，曹鳴慶，秦智偉.青花菜游離小孢子培養(yǎng)、胚胎發(fā)生和植株再生[J].華北農(nóng)學報，1998，13(3):102-106.
[8] 趙前程，吉立柱，蔡榮旗，等.花椰菜游離小孢子培養(yǎng)及植株再生研究[J].華北農(nóng)學報，2007，22(6):65-68.
[9] 李超，饒勇，陳靜，
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